ABSTRACT Intrinsically disordered proteins (IDPs) often contain proline residues, which undergo cis/trans isomerisation. While molecular dynamics (MD) simulations have the potential to fully characterise the proline cis and trans sub-ensembles, they are limited by the slow timescales of isomerisation and force field inaccuracies. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can report on ensemble-averaged observables for both the cis and trans proline states, but a full atomistic characterisation of these sub-ensembles is challenging. Given the importance of proline cis/trans isomerisation for influencing the conformational sampling of disordered proteins, we employed a combination of all-atom MD simulations with enhanced sampling (metadynamics), NMR, and small-angle X-ray scattering (SAXS) to characterise the two sub-ensembles of the ORF6 C-terminal region (ORF6 CTR ) from SARS-CoV-2 corresponding to the proline-57 (P57) cis and trans states. We performed MD simulations in three distinct force fields: AMBER03ws, AMBER99SB- disp , and CHARMM36m, which are all optimised for disordered proteins. Each simulation was run for an accumulated time of 180-220 µs until convergence was reached, as assessed by blocking analysis. A good agreement between the cis -P57 populations predicted from metadynamics simulations in AMBER03ws was observed with populations obtained from experimental NMR data. Moreover, we observed good agreement between the radius of gyration predicted from the metadynamics simulations in AMBER03ws and that measured using SAXS. Our findings suggest that both the cis -P57 and trans -P57 conformations of ORF6 CTR are extremely dynamic and that interdisciplinary approaches combining both multi-scale computations and experiments offer avenues to explore highly dynamic states that cannot be reliably characterised by either approach in isolation. SIGNIFICANCE This study employs MD simulations (with metadynamics), NMR spectroscopy, and SAXS to elucidate the individual cis and trans proline conformations of ORF6 CTR from SARS-CoV-2. The good agreement on proline cis / trans populations observed in experiments (NMR) and those calculated from simulations in the AMBER03ws force field (with SAXS reweighting) showcases the efficiency of this interdisciplinary approach, which can be used to characterise highly dynamic disordered protein states, even for very slow processes. Furthermore, our study emphasises the importance of considering both computational and experimental methodologies to gain a more holistic understanding of highly dynamic proteins. The presented integrative approach sets a precedent for future studies aiming to explore complex and dynamic biological systems with slow transitions such as proline isomerisations.

Cyclisation of peptides by forming thioether (lanthionine), disulfide (cystine) or methylene thioacetal bridges between side chains is established as an important tool to stabilise a given structure, enhance metabolic stability and optimise both potency and selectivity. However, a systematic comparative study of the effects of differing bridging modalities on peptide conformation has not previously been carried out. In this paper, we have used the NMR deconvolution algorithm, NAMFIS, to determine the conformational ensembles, in aqueous solution, of three cyclic analogues of angiotensin(1‐7), incorporating either disulfide, or non‐reduceable thioether or methylene thioacetal bridges. We demonstrate that the major solution conformations are conserved between the different bridged peptides, but the distribution of conformations differs appreciably. This suggests that subtle differences in ring size and bridging structure can be exploited to fine‐tune the conformational properties of cyclic peptides, which may modulate their bioactivities.

Intrinsically disordered proteins are highly dynamic biomolecules that rapidly interconvert between many structural conformations. Traditionally, these proteins have been considered un-druggable because of their lack of classical long-lived binding pockets. Recent evidence suggests that intrinsically disordered proteins can bind small, drug-like molecules, however, there are limited approaches to characterize these interactions experimentally. Here we demonstrate that ligand-detected 19 F transverse relaxation rates ( R 2 ) obtained from Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy are highly sensitive to the interaction between a small-molecule and an intrinsically disordered protein, in contrast to chemical shift perturbations which are minimally sensitive for this interaction. With this method, we show that the small molecule, 5-fluoroindole, interacts with the disordered domains of non-structural protein 5A from hepatitis C virus with a K d of 260 ± 110 μM. We also demonstrate that 5-fluoroindole remains highly dynamic in the bound form. Our findings suggest that ligand-detected 19 F transverse relaxation measurements could represent a highly effective screening strategy to identify molecules capable of interacting with these traditionally elusive, dynamic biomolecules.

Intrinsically disordered proteins (IDPs) often contain proline residues, which undergo cis/trans isomerisation. While molecular dynamics (MD) simulations have the potential to fully characterise the proline cis and trans sub-ensembles, they are limited by the slow timescales of isomerisation and force field inaccuracies. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can report on ensemble-averaged observables for both the cis-proline and trans-proline states, but a full atomistic characterisation of these conformers is challenging. Given the importance of proline cis/trans isomerisation for influencing the conformational sampling of disordered proteins, we employed a combination of all-atom MD simulations with enhanced sampling (metadynamics), NMR, and small-angle X-ray scattering (SAXS) to characterise the two sub-ensembles of the ORF6 C-terminal region (ORF6