Abstract Objective To characterise peritoneal macrophage populations in women with suspected endometriosis and assess if they are correlated with severity of pelvic pain symptoms. Design Flow cytometry analysis of peritoneal fluid samples and clinical data. Setting University Research Institute. Patients Clinical questionnaires, surgical data and peritoneal fluid were collected with informed consent from women undergoing diagnostic laparoscopy for suspected endometriosis (n=54). Intervention(s) None Main Outcome Measure(s) Severity of pelvic pain symptoms was assessed by the EHP-30 questionnaire. Immune cells recovered from peritoneal fluid were analysed by flow cytometry. Results Pain scores (pain domain of EHP30) did not differ according to endometriosis diagnosis, stage of endometriosis or whether or not women were receiving hormone treatment. Analysis of immune cells in peritoneal fluid revealed two populations of peritoneal macrophages: CD14 high and CD14 low which were not altered by menstrual cycle phase or hormone treatment. CD14 high peritoneal macrophages were increased in women with endometriosis compared to those without but were not altered by coincident reproductive health issues such as infertility or heavy menstrual bleeding. Peritoneal macrophage phenotype correlated with pelvic pain symptoms in women with suspected endometriosis. Notably, CD14 high peritoneal macrophages negatively correlated with pain scores whereas CD14 low peritoneal macrophages were positively correlated. This association was independent of endometriosis diagnosis. Conclusion Peritoneal macrophage phenotypes correlate with pelvic pain symptoms in women with suspected endometriosis and are altered by presence of disease. These results provide new insight into the association between endometriosis pathophysiology and pelvic pain symptoms.

Study question: Does the oestrogen receptor isoform, ER46, contribute to regulation of endometrial function? Summary answer: ER46 is expressed in endometrial tissues during the proliferative and secretory phases and is the predominant ERα isoform in first trimester decidua. ER46 is abundantly expressed in uterine NK (uNK) cells and localised to the cell membrane. Activation of ER46 regulates the function of human uNK cells by increasing cell motility. What is known already: Oestrogens acting via their cognate receptors are essential regulators of endometrial function and play key roles in establishment of pregnancy. ER46 is a 46kDa truncated isoform of full length ERα (ER66, encoded by ESR1) that contains both ligand and DNA binding domains. Expression of ER46 in human endometrium has not been investigated previously. ER46 is located at the cell membrane of peripheral blood leukocytes and mediates rapid responses to oestrogens. UNK cells are a phenotypically distinct (CD56brightCD16-) population of tissue-resident immune cells that regulate vascular remodelling within the endometrium and decidua. We have shown that oestrogens stimulate rapid increases in uNK cell motility. Previous characterisation of uNK cells suggests they are ER66-negative but expression of ER46 has not been characterised. We hypothesise that uNK cells express ER46 and that rapid responses to oestrogens are mediated via this receptor. Study design, size, duration: This laboratory-based study used primary human endometrial (n=24) and decidual tissue biopsies (n=30) as well as uNK cells which were freshly isolated from first trimester human decidua (n=18). Participants/materials, setting, methods: Primary human endometrial and first trimester decidual tissue biopsies were collected using methods approved by the local institutional ethics committee (LREC/05/51104/12 and LREC/10/51402/59). The expression of oestrogen receptors (ER66, ER46 and ERβ) was assessed by qPCR, western blot and immunohistochemistry. Uterine Natural Killer (uNK) cells were isolated from first trimester human decidua by magnetic bead sorting. Cell motility of uNK cells was measured by live cell imaging: cells were treated with oestradiol (E2)-BSA (10nM equivalent), the ERβ-selective agonist 2,3-bis (4-hydroxyphenyl)-propionitrile (DPN; 10nM) or vehicle control (DMSO). Main results and the role of chance: ER46 was detected in proliferative and secretory phase tissues and was the predominant ERα isoform in first trimester decidua samples. Immunohistochemistry revealed ER46 was co-localised with ER66 in cell nuclei during the proliferative phase but detected in both the cytoplasm and cell membrane of stromal cells in the secretory phase and in decidua. Triple immunofluorescence staining of decidua tissues identified expression of ER46 in the cell membrane of CD56-positive uNK cells which were otherwise ER66-negative. Profiling of isolated uNK cells confirmed expression ER46 and localised ER46 protein to the cell membrane. Functional analysis of isolated uNK cells using live cell imaging demonstrated that activation of ER46 with E2-BSA significantly increased uNK cell motility. Limitations, reasons for caution: Expression patterns in endometrial tissue was only determined using samples from proliferative and secretory phases. Assessment of first trimester decidua samples was from a range of gestational ages which may have precluded insights into gestation specific changes in these tissues. Our results are based on in vitro responses of primary human cells and we cannot be certain that similar mechanisms occur in situ. Wider implications of the findings: E2 is an essential regulator of reproductive competence. This study provides the first evidence for expression of ER46 in human endometrium and decidua of early pregnancy. We describe a mechanism for regulating the function of human uNK cells via expression of ER46 and demonstrate that selective targeting with E2-BSA regulates uNK cell motility. These novel findings identify a role for ER46 in human endometrium and provide unique insight into the importance of membrane-initiated signalling in modulating the impact of E2 on uNK cell function in women. Study funding/competing interest(s): These studies were supported by MRC Programme Grants G1100356/1 and MR/N024524/1 to PTKS. HODC was supported by MRC grant G1002033.

SUMMARY Endometriosis is a common and debilitating neuro-inflammatory disorder that is associated with chronic pain. Definitive diagnosis is based on the presence of endometrial-like tissue (lesions) in sites outside the uterus. Kynurenine monooxygenase (KMO) is a mitochondrial enzyme of tryptophan metabolism that regulates inflammation and immunity. Here, we show that KMO is expressed in epithelial cells in human endometriosis tissue lesions and in corresponding lesions in a mouse model of endometriosis. In mice, oral treatment with the potent KMO inhibitor KNS898 induced a biochemical state of KMO blockade with accumulation of kynurenine, diversion to kynurenic acid and ablation of 3-hydroxykynurenine production. In the mouse model of endometriosis, KMO inhibition improved histological outcomes and endometriosis pain-like behaviours, even when KNS898 treatment commenced one week after initiation of lesions. Taken together, these results suggest that KMO blockade is a promising new non-hormonal therapeutic modality for endometriosis.

Innate lymphoid cells (ILC) are prominent in the human uterine mucosa and play physiological roles in pregnancy. ILC3 are the second-most common ILC subset in the uterine mucosa, but their role remains unclear. Here we define two subsets of lineage-negative CD56+ CD117+ CRTH2-uterine ILC3, distinguished by their expression of CD127. The CD127-subset is most numerous and active during menstruation and immediately after parturition, suggesting a role in repair of the uterine mucosa (called endometrium outside of pregnancy); the CD127+ subset is most numerous and active immediately after menstruation, as the endometrium regenerates. In healthy endometrium, ILC3 are spatially associated with glandular epithelial and endothelial cells, which both express receptors for the ILC3-derived cytokines, IL-22 and IL-8. In the eutopic endometrium of people with endometriosis, ILC3 are located further from glandular epithelial and endothelial cells suggesting that these cells may be less exposed to ILC3 products, potentially with negative consequences for endometrial regeneration. Our findings highlight the dynamic nature of ILC3 in the uterine mucosa and suggest their primary role is in repair and regeneration. An improved understanding of uterine ILC3 will inform future research on endometrial health and disease.

Abstract Endometriosis is a leading cause of pain and infertility affecting millions of women globally. Identifying biologic and genetic effects on DNA methylation (DNAm) in endometrium increases understanding of mechanisms that influence gene regulation predisposing to endometriosis and offers an opportunity for novel therapeutic target discovery. Herein, we characterize variation in endometrial DNAm and its association with menstrual cycle phase, endometriosis, and genetic variants through analysis of genome-wide genotype data and methylation at 759,345 DNAm sites in endometrial samples from 984 deeply-phenotyped participants. We identify significant differences in DNAm profiles between menstrual cycle phases and at four DNAm sites between stage III/IV endometriosis and controls. We estimate that 15.4% of the variation in endometriosis is captured by DNAm, and identify DNAm networks associated with endometriosis. DNAm quantitative trait locus (mQTL) analysis identified 118,185 independent cis -mQTL including some tissue-specific effects. We find significant differences in DNAm profiles between endometriosis sub- phenotypes and a significant association between genetic regulation of methylation in endometrium and disease risk, providing functional evidence for genomic targets contributing to endometriosis risk and pathogenesis.