The multiprotein mTORC1 protein kinase complex is the central component of a pathway that promotes growth in response to insulin, energy levels, and amino acids and is deregulated in common cancers. We find that the Rag proteins—a family of four related small guanosine triphosphatases (GTPases)—interact with mTORC1 in an amino acid–sensitive manner and are necessary for the activation of the mTORC1 pathway by amino acids. A Rag mutant that is constitutively bound to guanosine triphosphate interacted strongly with mTORC1, and its expression within cells made the mTORC1 pathway resistant to amino acid deprivation. Conversely, expression of a guanosine diphosphate–bound Rag mutant prevented stimulation of mTORC1 by amino acids. The Rag proteins do not directly stimulate the kinase activity of mTORC1, but, like amino acids, promote the intracellular localization of mTOR to a compartment that also contains its activator Rheb.

Cellular sensing of amino acids occurs at the lysosome and is mediated by the vacuolar proton pump.

The mTOR complex 1 (mTORC1) pathway promotes cell growth in response to many cues, including amino acids, which act through the Rag guanosine triphosphatases (GTPases) to promote mTORC1 translocation to the lysosomal surface, its site of activation. Although progress has been made in identifying positive regulators of the Rags, it is unknown if negative factors also exist. Here, we identify GATOR as a complex that interacts with the Rags and is composed of two subcomplexes we call GATOR1 and -2. Inhibition of GATOR1 subunits (DEPDC5, Nprl2, and Nprl3) makes mTORC1 signaling resistant to amino acid deprivation. In contrast, inhibition of GATOR2 subunits (Mios, WDR24, WDR59, Seh1L, and Sec13) suppresses mTORC1 signaling, and epistasis analysis shows that GATOR2 negatively regulates DEPDC5. GATOR1 has GTPase-activating protein (GAP) activity for RagA and RagB, and its components are mutated in human cancer. In cancer cells with inactivating mutations in GATOR1, mTORC1 is hyperactive and insensitive to amino acid starvation, and such cells are hypersensitive to rapamycin, an mTORC1 inhibitor. Thus, we identify a key negative regulator of the Rag GTPases and reveal that, like other mTORC1 regulators, Rag function can be deregulated in cancer.

The mTOR Complex 1 (mTORC1) pathway regulates cell growth in response to numerous cues, including amino acids, which promote mTORC1 translocation to the lysosomal surface, its site of activation. The heterodimeric RagA/B-RagC/D GTPases, the Ragulator complex that tethers the Rags to the lysosome, and the v-ATPase form a signaling system that is necessary for amino acid sensing by mTORC1. Amino acids stimulate the binding of guanosine triphosphate to RagA and RagB but the factors that regulate Rag nucleotide loading are unknown. Here, we identify HBXIP and C7orf59 as two additional Ragulator components that are required for mTORC1 activation by amino acids. The expanded Ragulator has nucleotide exchange activity toward RagA and RagB and interacts with the Rag heterodimers in an amino acid- and v-ATPase-dependent fashion. Thus, we provide mechanistic insight into how mTORC1 senses amino acids by identifying Ragulator as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for the Rag GTPases.

Sensing amino acids at the lysosome The mTORC1 protein kinase is a complex of proteins that functions to regulate growth and metabolism. Activity of mTORC1 is sensitive to the abundance of amino acids, but how the sensing of amino acids is coupled to the control of mTORC1 has been unclear. Wang et al. searched for predicted membrane proteins that interacted with regulators of mTORC1. They identified a protein currently known only as SLC38A9. Interaction of SLC38A9 with mTORC1 regulators was sensitive to the presence of amino acids. SLC38A9 has sequence similarity to amino acid transporters. Effects of modulation of SLC38A9 in cultured human cells indicate that it may be the sensor that connects the abundance of arginine and leucine to mTORC1 activity. Science , this issue p. 188

The mTORC1 kinase is a master growth regulator that senses numerous environmental cues, including amino acids. The Rag GTPases interact with mTORC1 and signal amino acid sufficiency by promoting the translocation of mTORC1 to the lysosomal surface, its site of activation. The Rags are unusual GTPases in that they function as obligate heterodimers, which consist of RagA or B bound to RagC or D. While the loading of RagA/B with GTP initiates amino acid signaling to mTORC1, the role of RagC/D is unknown. Here, we show that RagC/D is a key regulator of the interaction of mTORC1 with the Rag heterodimer and that, unexpectedly, RagC/D must be GDP bound for the interaction to occur. We identify FLCN and its binding partners, FNIP1/2, as Rag-interacting proteins with GAP activity for RagC/D, but not RagA/B. Thus, we reveal a role for RagC/D in mTORC1 activation and a molecular function for the FLCN tumor suppressor.

The mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) kinase is a major regulator of cell growth that responds to numerous environmental cues. A key input is amino acids, which act through the heterodimeric Rag GTPases (RagA or RagB bound to RagC or RagD) in order to promote the translocation of mTORC1 to the lysosomal surface, its site of activation. GATOR2 is a complex of unknown function that positively regulates mTORC1 signaling by acting upstream of or in parallel to GATOR1, which is a GTPase-activating protein (GAP) for RagA or RagB and an inhibitor of the amino-acid-sensing pathway. Here, we find that the Sestrins, a family of poorly understood growth regulators (Sestrin1–Sestrin3), interact with GATOR2 in an amino-acid-sensitive fashion. Sestrin2-mediated inhibition of mTORC1 signaling requires GATOR1 and the Rag GTPases, and the Sestrins regulate the localization of mTORC1 in response to amino acids. Thus, we identify the Sestrins as GATOR2-interacting proteins that regulate the amino-acid-sensing branch of the mTORC1 pathway.

Mutant-selective KRASG12C inhibitors, such as MRTX849 (adagrasib) and AMG 510 (sotorasib), have demonstrated efficacy in KRASG12C-mutant cancers, including non-small cell lung cancer (NSCLC). However, mechanisms underlying clinical acquired resistance to KRASG12C inhibitors remain undetermined. To begin to define the mechanistic spectrum of acquired resistance, we describe a patient with KRASG12C NSCLC who developed polyclonal acquired resistance to MRTX849 with the emergence of 10 heterogeneous resistance alterations in serial cell-free DNA spanning four genes (KRAS, NRAS, BRAF, MAP2K1), all of which converge to reactivate RAS-MAPK signaling. Notably, a novel KRASY96D mutation affecting the switch-II pocket, to which MRTX849 and other inactive-state inhibitors bind, was identified that interferes with key protein-drug interactions and confers resistance to these inhibitors in engineered and patient-derived KRASG12C cancer models. Interestingly, a novel, functionally distinct tricomplex KRASG12C active-state inhibitor RM-018 retained the ability to bind and inhibit KRASG12C/Y96D and could overcome resistance. SIGNIFICANCE: In one of the first reports of clinical acquired resistance to KRASG12C inhibitors, our data suggest polyclonal RAS-MAPK reactivation as a central resistance mechanism. We also identify a novel KRAS switch-II pocket mutation that impairs binding and drives resistance to inactive-state inhibitors but is surmountable by a functionally distinct KRASG12C inhibitor.See related commentary by Pinnelli and Trusolino, p. 1874.This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 1861.