The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental manipulations that are aimed at rendering or preventing depressive-like states. Mice are placed in an inescapable transparent tank that is filled with water and their escape related mobility behavior is measured. The forced swim test is straightforward to conduct reliably and it requires minimal specialized equipment. Successful implementation of the forced swim test requires adherence to certain procedural details and minimization of unwarranted stress to the mice. In the protocol description and the accompanying video, we explain how to conduct the mouse version of this test with emphasis on potential pitfalls that may be detrimental to interpretation of results and how to avoid them. Additionally, we explain how the behaviors manifested in the test are assessed.

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that are expected to affect depression related behaviors. Mice are suspended by their tails with tape, in such a position that it cannot escape or hold on to nearby surfaces. During this test, typically six minutes in duration, the resulting escape oriented behaviors are quantified. The tail-suspension test is a valuable tool in drug discovery for high-throughput screening of prospective antidepressant compounds. Here, we describe the details required for implementation of this test with additional emphasis on potential problems that may occur and how to avoid them. We also offer a solution to the tail climbing behavior, a common problem that renders this test useless in some mouse strains, such as the widely used C57BL/6. Specifically, we prevent tail climbing behaviors by passing mouse tails through a small plastic cylinder prior to suspension. Finally, we detail how to manually score the behaviors that are manifested in this test.

Abstract Compulsive behaviors are a hallmark symptom of obsessive compulsive disorder (OCD). Striatal hyperactivity has been linked to compulsive behavior generation in correlative studies in humans and causal studies in rodents. However, the contribution of the two distinct striatal output populations to the generation and treatment of compulsive behavior is unknown. These populations of direct and indirect pathway-projecting spiny projection neurons (SPNs) have classically been thought to promote or suppress actions, respectively, leading to a long-held hypothesis that increased output of direct relative to indirect pathway promotes compulsive behavior. Contrary to this hypothesis, here we find that indirect pathway hyperactivity drives compulsive grooming in the Sapap3 -knockout mouse model of OCD-relevant behavior. Furthermore, we show that suppression of indirect pathway activity using optogenetics or treatment with the first-line OCD pharmacotherapy fluoxetine is associated with reduced compulsive behavior. Together, these findings highlight the striatal indirect pathway as a potential new treatment target for compulsive behavior.

Abstract Medial nucleus accumbens shell (mNAcSh) is a critical brain region for driving motivated behaviors. Despite this well-established role, the underlying reward processing of individual neurons, circuits and cell-types within mNAcSh remains largely unknown. Here, we leverage deep brain 2-photon calcium imaging through endoscopic lenses to record mNAcSh spiny projection neuron (SPN) ensemble responses to rewards of different preference and to reward-predictive cues across cue-reward learning. Reward responses were found to be heterogeneous and particularly differentiated based on reward preference and cell type. A large subpopulation of reward-excited enkephalinergic SPNs were found to be specifically recruited during consumption of unpreferred rewards. A major enkephalinergic efferent projection from mNAcSh to ventral pallidum (VP) was also found to be recruited to unpreferred rewards and to causally drive low positive reward preference. Enkephalin and dynorphinergic SPNs in mNAcSh distinctly represent rewards of different preference and propagate distinct signals through efferent projections to drive consummatory behavior.

Summary The basolateral amygdala (BLA) is an evolutionarily conserved brain region, well known for valence processing. Despite this central role, the relationship between activity of BLA neuronal ensembles in response to appetitive and aversive stimuli and the subsequent expression of valence-specific behavior has remained elusive. Here we leverage 2-photon calcium imaging combined with single cell holographic photostimulation through an endoscopic lens implanted in the deep brain to demonstrate a direct causal role for discrete ensembles of BLA neurons in the control of oppositely valenced behavior. We report that targeted photostimulation of individual groups of appetitive or aversive BLA neurons shifts behavioral responses toward those behaviors which recruited a specific consumption or avoidance ensemble. Here we identify that neuronal encoding of valence in the BLA is graded and relies on the relative proportion of individual BLA neurons recruited in a stable appetitive or aversive ensemble.

Abstract Mu-opioid peptide receptor (MOPR) stimulation alters respiration, analgesia, and reward behavior, and can induce addiction and drug overdose. Despite its evident importance, the endogenous mechanisms for MOPR regulation of appetitive behavior have remained unknown. Here we report that endogenous MOPR regulation of appetitive behavior in mice acts through a specific dorsal raphe to nucleus accumbens projection. MOPR-mediated inhibition of raphe terminals is necessary and sufficient to determine appetitive behavioral state while select enkephalin-containing NAc ensembles are engaged prior to reward consumption, suggesting that local enkephalin release is the source of endogenous MOPR ligand. Selective modulation of NAc enkephalin neurons and CRISPR-Cas9-mediated disruption of enkephalin substantiate this finding. These results isolate a fundamental endogenous opioid circuit for state-dependent appetitive behavior and suggest alternative mechanisms for opiate modulation of reward.

Abstract Compulsive behaviors are a hallmark symptom of obsessive compulsive disorder (OCD). Striatal hyperactivity has been linked to compulsive behavior generation in correlative studies in humans and causal studies in rodents. However, the contribution of the two distinct striatal output populations to the generation and treatment of compulsive behavior is unknown. These populations of direct and indirect pathway-projecting spiny projection neurons (SPNs) have classically been thought to promote or suppress actions, respectively, leading to a long-held hypothesis that increased output of direct relative to indirect pathway promotes compulsive behavior. Contrary to this hypothesis, here we find that indirect pathway hyperactivity is associated with compulsive grooming in the Sapap3 -knockout mouse model of OCD-relevant behavior. Furthermore, we show that suppression of indirect pathway activity using optogenetics or treatment with the first-line OCD pharmacotherapy fluoxetine is associated with reduced grooming in Sapap3 -knockouts. Together, these findings highlight the striatal indirect pathway as a potential treatment target for compulsive behavior.

Abstract Background Patients with obsessive-compulsive disorder (OCD) display disrupted performance and abnormal lateral orbitofrontal cortex (LOFC) activity during reversal learning tasks, yet it is unknown whether compulsions and reversal learning deficits share a common neural substrate. To answer this question, we measured neural activity with in vivo calcium imaging in LOFC during compulsive grooming and reversal learning before and after fluoxetine treatment. Methods Sapap3 -knockout (KO) mice were used as a model for OCD-relevant behaviors. Sapap3 -KOs and control littermates were injected with virus encoding GCaMP6f and implanted with gradient-index lenses to visualize LOFC activity using miniature microscopes. Grooming, reversal learning, and neural activity were measured pre- and post-fluoxetine treatment (18mg/kg, 4 weeks). Results Baseline compulsive grooming and reversal learning impairments in KOs improved after fluoxetine treatment. Additionally, KOs display distinct patterns of abnormal LOFC activity during grooming and reversal learning, both of which normalize after fluoxetine. Finally, modulation in response to reversal learning and compulsive behavior are independent, as reversal learning-associated neurons are distributed randomly amongst grooming-associated neurons (i.e. overlap is what would be expected by chance). Conclusions In OCD, the LOFC is disrupted during both compulsive behaviors and reversal learning, yet whether these behaviors share common neural underpinnings is unknown. We find that the LOFC plays distinct and independent roles in compulsive grooming and impaired reversal learning and their improvement with fluoxetine. These findings suggest that LOFC plays separate roles in pathophysiology and treatment of different perseverative behaviors in OCD.

Although much is known about how corticostriatal circuits mediate behavioral selection, most previous work has been conducted in highly trained animals engaged in instrumental tasks. Understanding how corticostriatal circuits mediate behavioral selection and initiation in a naturalistic setting is critical to understanding how the brain chooses and executes behavior in unconstrained situations. Central striatum (CS), an understudied region that lies in the middle of the motor-limbic topography, is well-poised to play an important role in these processes since its main cortical inputs ([Corbit et al., 2019][1]) have been implicated in behavioral flexibility (lateral orbitofrontal cortex ([Kim and Ragozzino, 2005][2])) and response preparation (anterior lateral motor area, ALM) ([Li et al., 2015][3]), However, although CS activity has been associated with conditioned grooming behavior in transgenic mice ([Burguiere et al., 2013][4]), the role of CS and its cortical inputs in the selection of spontaneous behaviors has not been explored. We therefore studied the role of CS corticostriatal circuits in behavioral selection in an open field context.Surprisingly, using fiber photometry in this unconstrained environment, we found that population calcium activity in CS was specifically increased at onset of grooming, and not at onset of other spontaneous behaviors such as rearing or locomotion. Supporting a potential selective role for CS in the initiation of grooming, bilateral optogenetic stimulation of CS evoked immediate onset grooming-related movements. However, these movements resembled subcomponents of grooming behavior and not full-fledged grooming bouts, suggesting that additional input(s) are required to appropriately sequence and sustain this complex motor behavior once initiated. Consistent with this idea, optogenetic stimulation of CS inputs from ALM generated sustained grooming responses that evolved on a time-course paralleling CS activation monitored using single-cell calcium imaging. Furthermore, fiber photometry in ALM demonstrated a gradual ramp in calcium activity that peaked at time of grooming termination, supporting a potential role for ALM in encoding length of this spontaneous sequenced behavior. Finally, dual color dual region fiber photometry indicated that CS activation precedes ALM during naturalistic grooming sequences. Taken together, these data support a novel model in which CS activity is sufficient to initiate grooming behavior, but ALM activity is necessary to sustain and encode the length of grooming bouts. Thus, the use of an unconstrained behavioral paradigm has allowed us to uncover surprising roles for CS and ALM in the initiation and maintenance of spontaneous sequenced behaviors. [1]: #ref-10 [2]: #ref-26 [3]: #ref-29 [4]: #ref-9