Focused Ultrasound (FUS) coupled with intravenous administration of microbubbles (MB) is a non-invasive technique that has been shown to reliably open (increase the permeability of) the blood-brain barrier (BBB) in multiple in vivo models including non-human primates (NHP). This procedure has shown promise for clinical and basic science applications, yet the safety and potential neurological effects of long term application in NHP requires further investigation under parameters shown to be efficacious in that species (500kHz, 200–400 kPa, 4–5μm MB, 2 minute sonication). In this study, we repeatedly opened the BBB in the caudate and putamen regions of the basal ganglia of 4 NHP using FUS with systemically-administered MB over 4–20 months. We assessed the safety of the FUS with MB procedure using MRI to detect edema or hemorrhaging in the brain. Contrast enhanced T1-weighted MRI sequences showed a 98% success rate for openings in the targeted regions. T2-weighted and SWI sequences indicated a lack edema in the majority of the cases. We investigated potential neurological effects of the FUS with MB procedure through quantitative cognitive testing of’ visual, cognitive, motivational, and motor function using a random dot motion task with reward magnitude bias presented on a touchpanel display. Reaction times during the task significantly increased on the day of the FUS with MB procedure. This increase returned to baseline within 4–5 days after the procedure. Visual motion discrimination thresholds were unaffected. Our results indicate FUS with MB can be a safe method for repeated opening of the BBB at the basal ganglia in NHP for up to 20 months without any long-term negative physiological or neurological effects with the parameters used.

Abstract Noninvasive brain stimulation using focused ultrasound has many potential applications as a research and clinical tool. Here, we investigated the effect of focused ultrasound (FUS) combined with systemically administered microbubbles on visual-motor decision-making behavior in monkeys. We applied FUS to the putamen in one hemisphere to open the blood-brain barrier, and then tested behavioral performance 3-4 hours later. On days when the monkeys were treated with FUS, their decisions were faster and more accurate than days without sonication. The performance improvement suggested both a shift in the decision criterion and an enhancement of the use of sensory evidence in the decision process. FUS also interacted with the effect of a low dose of haloperidol. The results suggest that a two-minute application of FUS can have a sustained impact on performance of complex cognitive tasks, and may increase the efficacy of psychoactive medications. The results lend further support to the idea that the dorsal striatum plays an integral role in evidence- and reward-based decision-making.

Alphaviruses such as Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) and Eastern equine encephalitis virus (EEEV) are arboviruses that can cause severe zoonotic disease in humans. Both VEEV and EEEV are highly infectious when aerosolized and can be used as biological weapons. Vaccines and therapeutics are urgently needed, but efficacy determination requires animal models. The cynomolgus macaque (Macaca fascicularis) provides a relevant model of human disease, but questions remain whether vaccines or therapeutics can mitigate CNS infection or disease in this model. The documentation of alphavirus encephalitis in animals relies on traditional physiological biomarkers and behavioral/neurological observations by veterinary staff; quantitative measurements such as electroencephalography (EEG) and intracranial pressure (ICP) can recapitulate underlying encephalitic processes. We detail a telemetry implantation method suitable for continuous monitoring of both EEG and ICP in awake macaques, as well as methods for collection and analysis of such data. We sought to evaluate whether changes in EEG/ICP suggestive of CNS penetration by virus would be seen after aerosol exposure of naïve macaques to VEEV IC INH9813 or EEEV V105 strains compared to mock-infection in a cohort of twelve adult cynomolgus macaques. Data collection ran continuously from at least four days preceding aerosol exposure and up to 50 days thereafter. EEG signals were processed into frequency spectrum bands (delta: [0.4 – 4Hz); theta: [4 – 8Hz); alpha: [8-12Hz); beta: [12-30] Hz) and assessed for viral encephalitis-associated changes against robust background circadian variation while ICP data was assessed for signal fidelity, circadian variability, and for meaningful differences during encephalitis. Results indicated differences in delta, alpha, and beta band magnitude in infected macaques, disrupted circadian rhythm, and proportional increases in ICP in response to alphavirus infection. This novel enhancement of the cynomolgus macaque model offers utility for timely determination of onset, severity, and resolution of encephalitic disease and for the evaluation of vaccine and therapeutic candidates.

Abstract Time-varying pitch is a vital cue for human speech perception. Neural processing of time-varying pitch has been extensively assayed using scalp-recorded frequency-following responses (FFRs), an electrophysiological signal thought to reflect integrated phase-locked neural ensemble activity from subcortical auditory areas. Emerging evidence increasingly points to a putative contribution of auditory cortical ensembles to the scalp-recorded FFRs. However, the properties of cortical FFRs and precise characterization of laminar sources are still unclear. Here we used direct human intracortical recordings as well as extra- and intracranial recordings from macaques and guinea pigs to characterize the properties of cortical sources of FFRs to time-varying pitch patterns. We found robust FFRs in the auditory cortex across all species. We leveraged representational similarity analysis as a translational bridge to characterize similarities between the human and animal models. Laminar recordings in animal models showed FFRs emerging primarily from the thalamorecepient layers of the auditory cortex. FFRs arising from these cortical sources significantly contributed to the scalp-recorded FFRs via volume conduction. Our research paves the way for a wide array of studies to investigate the role of cortical FFRs in auditory perception and plasticity. Significance Statement Frequency following responses (FFRs) to speech are scalp-recorded neural signals that inform the fidelity of sound encoding in the auditory system. FFRs, long believed to arise from brainstem and midbrain, have shaped our understanding of sub-cortical auditory processing and plasticity. Non-invasive studies have shown cortical contributions to the FFRs, however, this is still actively debated. Here we employed direct cortical recordings to trace the cortical contribution to the FFRs and characterize the properties of these cortical FFRs. With extra-cranial and intra-cranial recordings within the same subjects we show that cortical FFRs indeed contribute to the scalp-recorded FFRs, and their response properties differ from the sub-cortical FFRs. The findings provide strong evidence to revisit and reframe the FFR driven theories and models of sub-cortical auditory processing and plasticity with careful characterization of cortical and sub-cortical components in the scalp-recorded FFRs.

Abstract The frequency-following response (FFR) is a scalp-recorded electrophysiological potential that closely follows the periodicity of complex sounds such as speech. It has been suggested that FFRs reflect the linear superposition of responses that are triggered by the glottal pulse in each cycle of the fundamental frequency (F0 responses) and sequentially propagate through auditory processing stages in brainstem, midbrain, and cortex. However, this conceptualization of the FFR is debated, and it remains unclear if and how well a simple linear superposition can capture the spectro-temporal complexity of FFRs that are generated within the highly recurrent and non-linear auditory system. To address this question, we used a deconvolution approach to compute the hypothetical F0 responses that best explain the FFRs in rhesus monkeys to human speech and click trains with time-varying pitch patterns. The linear superposition of F0 responses explained well over 90% of the variance of click train steady state FFRs and well over 80% of mandarin tone steady state FFRs. The F0 responses could be measured with high signal-to-noise ratio and featured several spectro-temporally and topographically distinct components that likely reflect the activation of brainstem (<5ms; 200-1000 Hz), midbrain (5-15 ms; 100-250 Hz) and cortex (15-35 ms; ~90 Hz). In summary, our results in the monkey support the notion that FFRs arise as the superposition of F0 responses by showing for the first time that they can capture the bulk of the variance and spectro-temporal complexity of FFRs to human speech with time-varying pitch. These findings identify F0 responses as a potential diagnostic tool that may be useful to reliably link altered FFRs in speech and language disorders to altered F0 responses and thus to specific latencies, frequency bands and ultimately processing stages.

Background: The past years have seen increased appreciation of non-invasive extracranial electroencephalographic (EEG) recordings in non-human primates (NHP) as a tool for translational research. In humans, the international 10-20 system or extensions thereof provide standardized electrode positions that enable easy comparison of data between subjects and laboratories. In the NHP, no such generally accepted, standardized placement system is available. New Method: Here we introduce a surface metric and software package (NHP1020) that automates the planning of large, approximately evenly spaced electrode grids on the NHP skull. Results: The system is based on one CT and one MRI image and requires the user to specify two intracranial markers. Based on this, the software defines electrode positions on the brain surface using a surface-based spherical metric similar to the one used by the international 10-20 system. The electrode positions are then projected to the surface of the skull. Standardized electrode grids can be shared, imported or defined with few high-level commands. Existing Methods: NHP EEG electrodes are often placed on an individual basis relative to extracranial markers, or relative to underlying neural structures. Both approaches are time-consuming and require manual intervention. Furthermore, the use of extracranial markers in this species may be more problematic than in humans, because cranial muscles and ridges are larger and keep maturing long into adulthood thus potentially affecting electrode positions. Conclusion: The key advantage of the current approach is the automated and objective identification of corresponding electrode positions in different animals. Automation was made possible by the use of a two-dimensional metric on the brain surface which has a simpler, i.e., more convex and sphere-like anatomy than the skull. This enables fast and efficient planning, optimization and calculation of large electrode grids.

Abstract The primate brain is a densely interconnected organ whose function is best understood by recording from the entire structure in parallel, rather than parts of it in sequence. However, available methods either have limited temporal resolution (functional magnetic resonance imaging), limited spatial resolution (macroscopic electroencephalography), or a limited field of view (microscopic electrophysiology). To address this need, we developed a volumetric, mesoscopic recording approach ( MePhys ) by tessellating the volume of a monkey hemisphere with 992 electrode contacts that were distributed across 62 chronically implanted multi-electrode shafts. We showcase the scientific promise of MePhys by describing the functional interactions of local field potentials between the more than 300,000 simultaneously recorded pairs of electrodes. We find that a subanesthetic dose of ketamine –believed to mimic certain aspects of psychosis– can create a pronounced state of functional disconnection and prevent the formation of stable large-scale intrinsic states. We conclude that MePhys provides a new and fundamentally distinct window into brain function whose unique profile of strengths and weaknesses complements existing approaches in synergistic ways.

Mismatch negativity (MMN) is a macroscopic EEG deflection in response to rare or unexpected sounds. It has provided important insights into auditory short-term memory, pre-attentive guidance of attention, and their alteration in conditions such as schizophrenia. It remains unclear if MMN is caused by passive adaptation, active memory-comparison processes (deviance detection; DD), or a mix of both. To answer this question, macaque monkeys listened to a new paradigm that quantified both components of MMN. Micro- and macroscopic mismatch responses in the rhesus were dominated by adaptation at short latencies but included a smaller contribution of deviance detection at longer latencies. Most importantly, we show that mismatch responses mediated by adaptation have a short temporal scope and narrow frequency tuning while mismatch responses mediated by deviance detection have a longer temporal scope but broader frequency tuning. The different functional profiles point to the involvement of two distinct auditory short-term memory systems and complementary roles in the pre-attentive guidance of attention.

ABSTRACT Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) is a positively-stranded RNA arbovirus of the genus Alphavirus that causes encephalitis in humans. Cynomolgus macaques are a relevant model of the human disease caused by VEEV and are useful in exploring pathogenic mechanisms and the host response to VEEV infection. Macaques were exposed to small-particle aerosols containing virus derived from an infectious clone of VEEV strain INH-9813, a subtype IC strain isolated from a human infection. VEEV-exposed macaques developed a biphasic fever after infection similar to that seen in humans. Maximum temperature deviation correlated with the inhaled dose, but fever duration did not. Neurological signs, suggestive of virus penetration into the CNS, were predominantly seen in the second febrile period. Electroencephalography data indicated a statistically significant decrease in all power bands and circadian index during the second febrile period that returned to normal after fever resolved. Intracranial pressure increased late in the second febrile period. On day 6 post-infection macaques had high levels of MCP-1 and IP-10 chemokines in the CNS, as well as a marked increase of T lymphocytes and activated microglia. More than four weeks after infection, viral genomic RNA was found in the brain, cerebrospinal fluid and cervical lymph nodes. Pro-inflammatory cytokines & chemokines, infiltrating leukocytes and pathological changes were seen in the CNS tissues of macaques euthanized at these times. These data are consistent with persistence of virus replication and/or genomic RNA and potentially, inflammatory sequelae in the central nervous system after resolution of acute VEEV disease.