Summary Acute, specific, and robust inhibition of L-type Ca 2+ (Ca V 1) channels has been sought after for both research and therapeutic applications. Compared to other available Ca V 1 antagonists, genetically-encoded modulators, such as CMI (C-terminus mediated inhibition) peptides encoded by Ca V 1 DCT (distal C-terminus), hold great potentials due to its affirmative mechanisms of action on both gating and signaling. Here, we find that membrane-anchoring with a Ras tag could essentially help form a type of intramolecular-equivalent linkage, by which the tag anchored-peptide appears to dimerize with another protein or peptide on the membrane, supported by the evidence from patch-clamp electrophysiology and FRET imaging. We then design and implement the constitutive and inducible CMI modules, with appropriate dynamic ranges targeting the short and long variants of CaV1.3, both naturally occurring in neurons. Upon optical (infrared-responsive nanoparticles) and/or chemical (rapamycin) induction of FRB/FKBP binding, DCT peptides with no CMI in the cytosol acutely translocate onto the membrane via FRB-Ras, where the physical linkage requirement could be fulfilled. The peptides robustly produce acute and potent inhibitions on both recombinant CaV1.3 channels and neuronal CaV1 activities, and thus the Ca 2+ influx-neuritogenesis coupling. Validated through opto-chemogenetic induction, this prototype demonstrates channel modulation via membrane-assisted molecular linkage, promising broad applicability to diverse membrane proteins.

Abstract Dynamic Ca 2+ signals reflect acute changes in membrane excitability (e.g. sensory response), and also mediate intracellular signaling cascades normally of longer time scales (e.g., Ca 2+ -dependent neuritogenesis). In both cases, chronic Ca 2+ imaging has been often desired, but largely hindered by unexpected cytotoxicity intrinsic to GCaMP, a popular series of genetically-encoded Ca 2+ indicators. Here, we demonstrate that the recently developed GCaMP-X outperforms GCaMP in long-term probe expression and/or chronic Ca 2+ imaging. GCaMP-X shows much improved compatibility with neurons and thus more reliable than GCaMP as demonstrated in vivo by acute Ca 2+ responses to whisker deflection or spontaneous Ca 2+ fluctuations over an extended time frame. Chronic Ca 2+ imaging data ( ≥ 1 month) are acquired from the same set of cultured cortical neurons, unveiling that spontaneous/local Ca 2+ activities would progressively develop into autonomous/global Ca 2+ oscillations. Besides the morphological indices of neurite length or soma size, the major metrics of oscillatory Ca 2+ , including rate, amplitude, synchrony among different neurons or organelles have also been examined along with the developmental stages. Both neuritogenesis and Ca 2+ signals are dysregulated by GCaMP in virus-infected or transgenic neurons, in direct contrast to GCaMP-X without any noticeable side-effect. Such in vitro data altogether consolidate the unique importance of oscillatory Ca 2+ to activity-dependent neuritogenesis, as one major factor responsible for the distinctions between GCaMP vs GCaMP-X in vivo . For the first time with GCaMP-X of long-term expression in neurons, spontaneous and sensory-evoked Ca 2+ activities are imaged and evaluated both in vitro and in vivo , providing new opportunities to monitor neural development or other chronic processes concurrently with Ca 2+ dynamics.