ABSTRACT Adenosine deaminases acting on RNA (ADARs) can be repurposed to enable programmable RNA editing, however their exogenous delivery leads to transcriptome-wide off-targeting, and additionally, enzymatic activity on certain RNA motifs, especially those flanked by a 5’ guanosine is very low thus limiting their utility as a transcriptome engineering toolset. To address this, we explored comprehensive ADAR2 protein engineering via three approaches: First, we performed a novel deep mutational scan of the deaminase domain that enabled direct coupling of variants to corresponding RNA editing activity. Experimentally measuring the impact of every amino acid substitution across 261 residues, i.e. ~5000 variants, on RNA editing, revealed intrinsic domain properties, and also several mutations that greatly enhanced RNA editing. Second, we performed a domain-wide mutagenesis screen to identify variants that increased activity at 5’-GA-3 ’ motifs, and discovered novel mutants that enabled robust RNA editing. Third, we engineered the domain at the fragment level to create split deaminases. Notably, compared to full-length deaminase overexpression, split-deaminases resulted in >1000 fold more specific RNA editing. Taken together, we anticipate this comprehensive deaminase engineering will enable broader utility of the ADAR toolset for RNA biotechnology and therapeutic applications.

ABSTRACT Akin to short-hairpin RNAs and antisense oligonucleotides which efficaciously recruit endogenous cellular machinery such as Argonaute and RNase H to enable targeted RNA knockdown, simple long antisense guide RNAs ( 1 ) can recruit endogenous adenosine deaminases acting on RNA (ADARs) to enable programmable A-to-I RNA editing, without requiring co-delivery of any exogenous proteins. This approach is highly specific, however the efficiency is typically lower than observed with enzyme overexpression. Conjecturing this was due in part to the short half-life and residence times of guide RNAs, here we engineer highly stable c ircular AD AR recruiting guide RNAs (cadRNAs), which can be delivered not only by genetically encoding on DNA vectors, but also via transfection of RNA molecules transcribed in vitro . Using these cadRNAs, we observed robust RNA editing across multiple sites and cell lines, in both untranslated and coding regions of RNAs, vastly improved efficiency and durability of RNA editing, and high transcriptome-wide specificity. High transcript-level specificity was achieved by further engineering to reduce bystander editing. Additionally, in vivo delivery of cadRNAs via adeno-associated viruses (AAVs) enabled robust 38% RNA editing of the mPCSK9 transcript in C57BL/6J mice livers, and 12% UAG-to-UGG RNA correction of the amber nonsense mutation in the IDUA-W392X mouse model of mucopolysaccharidosis type I-Hurler (MPS I-H) syndrome. Taken together, cadRNAs enable efficacious programmable RNA editing with application across diverse protein modulation and gene therapeutic settings.

Summary Cyclin-dependent kinase 9 (CDK9) coordinates signaling events that regulate RNA polymerase II (Pol II) pause-release states. It is an important co-factor for transcription factors, such as MYC, that drive aberrant cell proliferation when their expression is deregulated. CDK9 modulation offers an approach for attenuating dysregulation in such transcriptional programs. As a result, numerous drug development campaigns to inhibit CDK9 kinase activity have been pursued. More recently, targeted degradation has emerged as an attractive approach. However, comprehensive evaluation of degradation versus inhibition is still critically needed to assess the biological contexts in which degradation might offer superior therapeutic benefits. We validated that CDK9 inhibition triggers a compensatory mechanism that dampens its effect on MYC expression and found that this feedback mechanism was absent when the kinase is degraded. Importantly, CDK9 degradation is more effective than its inhibition for disrupting MYC transcriptional regulatory circuitry likely through the abrogation of both enzymatic and scaffolding functions of CDK9. Highlights – KI-CDK9d-32 is a highly potent and selective CDK9 degrader. – KI-CDK9d-32 leads to rapid downregulation of MYC protein and mRNA transcripts levels. – KI-CDK9d-32 represses canonical MYC pathways and leads to a destabilization of nucleolar homeostasis. – Multidrug resistance ABCB1 gene emerged as the strongest resistance marker for the CDK9 PROTAC degrader.

ABSTRACT RNAs are a powerful therapeutic class. However their inherent transience impacts their activity both as an interacting moiety as well as a template. Circularization of RNA has been demonstrated as a means to improve persistence, however simple and scalable approaches to achieve this are lacking. Utilizing autocatalytic RNA circularization, here we engineer i n situ c ircularized RNAs (icRNAs). This approach enables icRNA delivery as simple linear RNA that is circularized upon delivery into the cell, thus making them compatible with routine synthesis, purification, and delivery formulations. We confirmed extensive protein translation from icRNAs both in vitro and in vivo and explored their utility in three contexts: first, we delivered the SARS-CoV-2 Omicron spike protein in vivo as icRNAs and showed corresponding induction of humoral immune responses; second, we demonstrated robust genome targeting via zinc finger nucleases delivered as icRNAs; and third, to enable compatibility between persistence of expression and immunogenicity, we developed a novel lo ng ra nge multiple x ed (LORAX) protein engineering methodology to screen progressively deimmunized Cas9 proteins, and demonstrated efficient genome and epigenome targeting via their delivery as icRNAs. We anticipate this highly simple and scalable icRNA methodology could have broad utility in basic science and therapeutic applications.