Abstract DNA, RNA, and proteins are synthesized using template molecules, but glycosylation is not believed to be constrained by a template. However, if cellular environment is the only determinant of glycosylation, all sites should receive the same glycans on average. This template-free assertion is inconsistent with observations of microheterogeneity—wherein each site receives distinct and reproducible glycan structures. Here, we test the assumption of template-free glycan biosynthesis. Through structural analysis of site-specific glycosylation data, we find protein-sequence and structural features that predict specific glycan features. To quantify these relationships, we present a new amino acid substitution matrix that describes “glycoimpact” -- how glycosylation varies with protein structure. High-glycoimpact amino acids co-evolve with glycosites, and glycoimpact is high when estimates of amino acid conservation and variant pathogenicity diverge. We report hundreds of disease variants near glycosites with high-glycoimpact, including several with known links to aberrant glycosylation (e.g., Oculocutaneous Albinism, Jakob-Creutzfeldt disease, Gerstmann-Straussler-Scheinker, and Gaucher’s Disease). Finally, we validate glycoimpact quantification by studying oligomannose-complex glycan ratios on HIV ENV, differential sialylation on IgG3 Fc, differential glycosylation on SARS-CoV-2 Spike, and fucose-modulated function of a tuberculosis monoclonal antibody. In all, we show glycan biosynthesis is accurately guided by specific, genetically-encoded rules, and this presents a plausible refutation to the assumption of template-free glycosylation. Summary Unlike DNA, RNA, and proteins, the dogma describes glycosylation as metabolically determined and unconstrained by template molecules. Without template-based expectations for glycan structures, research is hampered, obscuring how these critical molecules impact the behavior in thousands of human glycoproteins. Here, we challenge the assertion of template-free glycosylation and discover protein-encoded rules for glycan biosynthesis, by quantifying associations between glycan and protein features, which we call “glycoimpact.” We estimate 45-55% of amino acids substitutions will minimally change protein structure, but significantly impact glycosylation. We find that “glycoimpact” influences canonical substitution matrices and genetic variant pathogenicity. We identify thousands of high-glycoimpact pathogenic variants spanning hundreds of diseases, including several linked to aberrant glycosylation including Oculocutaneous Albinism, Prion, and Gaucher’s Disease. We also successfully predict glycosylation in HIV, SARS-CoV-2, and immunoglobulins. Overall, we present rules defining a genetic encoding for glycosylation, enabling glycan prediction and discovery of glycoprotein functions in health and disease.

Here we report novel tumour suppressor activity for the Drosophila Argonaute family RNA binding protein AGO1, a component of the miRNA-dependent RNA-induced silencing complex (RISC). The mechanism for growth inhibition does not, however, involve canonical roles as part of the RISC; rather AGO1 controls cell and tissue growth by functioning as a direct transcriptional repressor of the master regulator of growth, Myc. AGO1 depletion in wing imaginal discs drives a striking increase in ribosome biogenesis, nucleolar expansion, and cell growth in a manner dependent on Myc abundance. Moreover, increased Myc promoter activity and elevated Myc mRNA in AGO1 depleted animals requires RNA Pol II transcription. Further support for transcriptional AGO1 functions is provided by physical interaction with the RNA Pol II transcriptional machinery (chromatin remodelling factors and Mediator Complex), punctate nuclear localisation in euchromatic regions and overlap with Polycomb Group transcriptional silencing loci. Moreover, significant AGO1 enrichment is observed on the Myc promoter and AGO1 interacts with the Myc transcriptional activator Psi. Together our data show AGO1 functions outside of the miRNA-dependent RNA-induced silencing complex (RISC) to repress Myc transcription and inhibit cell and tissue growth during development.

Abstract Psi, the sole FUSE Binding Protein (FUBP) family single stranded DNA/RNA binding protein in Drosophila , is essential for proper cell and tissue growth, however its mechanism of function remains unclear. Here we use Targeted DamID combined with RNA-sequencing to generate the first genome-wide binding and expression profiles for Psi. Surprisingly, we demonstrate Psi drives growth in the Drosophila wing through transcriptional repression of key developmental pathways (e.g. Wnt, Notch and TGFβ). Thus, Psi patterns tissue growth by directly repressing transcription of developmental growth suppressors. Analysis of direct Psi targets identified novel growth inhibitors, including Tolkin (Zinc metallopeptidase implicated in TGFβ signalling), Ephexin (Rho-GEF) and emp (CD36 scavenger receptor-related protein). Their depletion not only suppressed impaired growth associated with Psi knockdown, but alone was sufficient to drive wing overgrowth. Thus, Psi drives wing growth twofold, through direct activation of Myc and through transcriptional repression of growth inhibitors comprising core developmental pathways.