Drug efflux machinery inherited asymmetrically In dividing bacterial cells, asymmetric distribution of cell wall constituents occurs between mother cells and their progeny. Asymmetric distribution of efflux machinery in a growing population of bacterial cells results in heterogeneity in antibiotic resistance. One consequence is that in the presence of low levels of antibiotic, older cells tend to live longer than younger cells. Using a microfluidic device to trap and measure dividing cells, Bergmiller et al. showed that AcrAB-TolC, the main multidrug efflux pump of Escherichia coli , clusters at the pole of older cells (see the Perspective by Barrett et al. ). As cell division proceeds and daughter cells age, they too gradually accumulate polar efflux pumps. Science , this issue p. 311 ; see also p. 247

Fisher suggested advantageous genes would spread through populations as a wave so we sought genetic waves in evolving populations, as follows. By fusing a fluorescent marker to a drug efflux protein (AcrB) whose expression provides Escherichia coli with resistance to some antibiotics, we quantified the evolution and spread of drug-resistant E. coli through spacetime using image analysis and quantitative PCR. As is done in hospitals routinely, we exposed the bacterium to a gradient of antibiotic in a ‘disk diffusion’ drug susceptibility test that we videoed. The videos show complex spatio-genomic patterns redolent of, yet more complex than, Fisher’s predictions whereby a decelerating wave front of advantageous genes colonises towards the antibiotic source, forming bullseye patterns en route and leaving a wave back of bacterial sub-populations expressing AcrB at decreasing levels away from the drug source. qPCR data show that E. coli sited at rapidly-adapting spatial hotspots gain 2 additional copies of acr , the operon that encodes AcrB, within 24h and imaging data show resistant sub-populations thrive most near the antibiotic source due to non-monotone relationships between inhibition due to antibiotic and distance from the source. In the spirit of Fisher, we provide an explicitly spatial nonlinear diffusion equation that exhibits these properties too. Finally, linear diffusion theory quantifies how the spatial extent of bacterial killing scales with increases in antibiotic dosage, predicting that microbes can survive chemotherapies that have been escalated to 250× the clinical dosage if the antibiotic is diffusion-limited.

We treated Escherichia coli with the antibiotic erythromycin from zero to high dosages to determine how the evolutionary dynamics of antibiotic resistant phenotypes and genotypes depend on dose. The most rapid increase in resistance was observed just below erythromycin's minimal inhibitory concentration (MIC) and genotype-phenotype correlations determined from whole genome sequencing revealed the molecular basis of this: simultaneous selection for copy number variation in 3 resistance mechanisms which shared an 'inverted-U' pattern of dose-dependent selection with several insertion sequences and an integron. Many genes did not conform to this pattern, however, because of changes in selection as dose increased: media adaptation at zero-to-low dosages gave way to drug target (ribosomal RNA operon) amplification at mid dosages whereas prophage-mediated drug efflux dominated at higher dosages where population densities were lowest. All dosages saw E. coli amplify the efflux operons acr and emrE at rates that correlated strongly with changes in population density that exhibited an inverted-U geometry too. However, we show by example that inverted-U geometries are not a universal feature of dose-resistance relationships.

Abstract CRISPR interference (CRISPRi) based on catalytically dead Cas9 nuclease of Streptococcus pyogenes is a programmable and highly flexible tool to interrogate gene function and essentiality in bacteria due to its ability to block transcription elongation at nearly any desired DNA target. Here, I assess how CRISPRi-dCas9 can be programmed to control the life cycle and infectivity of Escherichia coli bacteriophage T7, a highly virulent and obligatory lytic phage, by blocking critical host-dependent promoters that are required for host cell entry and life cycle execution. Using fluorescent reporters demonstrates that the efficacy of CRISPRi-dCas9 towards E. coli RNAP promoters depends on target promoter strength, and that the phage’s own T7 RNAP can be downregulated very efficiently. Effects on the time to lysis were partially dictated by the chronological order of phage DNA and dCas9 target appearance in the cell, suggesting an accessory role of E. coli RNAP during the early stages of T7 genome ejection. The stringency of the CRISPRi-dCas9 approach was greatly improved when using multiplex sgRNAs to target multiple phage regions simultaneously, resulting in a 25% increase in the time to lysis and up to 8-fold reduction in plaque size. Overall, this work expands CRISPRi-dCas9 as a flexible tool to non-invasively manipulate and probe the lifecycle and infectivity of otherwise native T7 phage.

Abstract Since bacteria lack a nucleus, the location of mRNA molecules is determined by the different characteristics of the encoded proteins, and the transcriptome is spatially arranged into cytosolic and membrane-associated mRNA. While translation of membrane protein-encoding mRNA has been studied in great mechanistic detail using biochemical methods, the spatiotemporal dynamics of this process remains poorly understood at the subcellular level. Here, we investigate the dynamics of individual fluorescently labelled mRNA molecules encoding the transmembrane serine chemoreceptor Tsr, to probe the mechanism of membrane protein translation. Analysis of tsr mRNA diffusion in the proximity of the plasma membrane revealed distinct diffusive modes that reflect the state of the mRNA molecule and its involvement in the process of active translation into the Sec secretion system. We find that the composition, and hence the fluidity of the membrane affects diffusion of membrane targeted mRNAs. Moreover, Tsr translation occurs in localized membrane regions, similar to eukaryotic hotspots. The hotspot localization coincides with the physical location of the transcribed gene, which itself is displaced towards the inner membrane. These findings suggest that inner membrane protein translation is a spatially defined process that occurs in hotspots, indicative of long-lived transertion sites. Our results show an additional layer of spatio-temporal structuring within the bacterial cell, thus revealing a qualitatively different understanding of the basic process of transcription and translation in bacteria. Significance Statement A large fraction of the bacterial proteome is directly synthesized into the inner membrane, and this process shapes the overall distribution of mRNA transcripts within the cell. Although highly dynamic in their nature, bacterial transcriptomes have mostly been studied in fixed cells. Here, we track individual mRNA molecules encoding the serine chemoreceptor in living bacterial cells and find that translation occurs in membrane hotspots that were previously exclusive to eukaryotes. Our results indicate an additional layer of spatio-temporal structuring within the bacterial cell that impacts our understanding of transcription and translation in bacteria.

ABSTRACT Bacteria have evolved a wide range of defense strategies to protect themselves against bacterial viruses (phages). However, the known mechanisms almost exclusively target phages with DNA genomes. While several bacterial toxin-antitoxin systems have been considered to cleave single-stranded bacterial RNA in response to stressful conditions, their role in protecting bacteria against phages with single-stranded RNA genomes has not been studied. Here we investigate the role of a representative toxin-antitoxin system, MazEF, in protecting Escherichia coli against two RNA phages – MS2 and Qβ. Our population-level experiments revealed that a mazEF deletion strain is more susceptible to RNA phage infection than the wild-type. At the single-cell level, deletion of the mazEF locus significantly shortened the time to lysis of individual bacteria challenged with RNA phage. At the genomic level, we found that the adenine-cytosine-adenine sequence, directly recognized and cleaved by the MazF toxin, is systematically underrepresented in the genomes of RNA phages that are known to infect E. coli , indicating selection for decreased probability of cleavage. These results suggest that in addition to other physiological roles, RNA-degrading toxin-antitoxin modules can function as a primitive immune system against RNA phages.