Abstract Two mesophilic, hydrogenotrophic methanogens, WWM1085 and M. smithii GRAZ-2 were isolated from human fecal samples. WWM1085 was isolated from an individual in the USA, and represents a novel species with in the genus Methanobrevibacter . M. smithii GRAZ-2 (= DSM 116045) was retrieved from fecal samples of a European, healthy female and represents a novel strain within this genus. Both Methanobrevibacter representatives form non-flagellated, short rods with variable morphologies and the capacity to form filaments. Both isolates showed the typical fluorescence of F 420 and methane production. Compared to M. smithii GRAZ-2, WWM1085 did not accumulate formate when grown on H 2 and CO 2 . The optimal growth conditions were at 37°C, and pH 7. Full genome sequencing revealed a genomic difference of WWM1085 to the type strain of M. smithii PS (type strain; DSM 861), with 93.55% ANI and major differences in the sequence of its mcrA gene (3.3% difference in nucleotide sequence). Differences in the 16S rRNA gene were very minor and thus distinction based on this sequence might not be possible. M. smithii GRAZ-2 was identified as a novel strain within the Methanobrevibacter genus (ANI 99.04 % to M. smithii PS). Due to the major differences of WWM1085 and M. smithii type strain PS in phenotypic, genomic and metabolic features, we propose M. intestini sp. nov. as a novel species with WWM1085 as the type strain (DSM 116060T = CECT 30992).

One potential mechanism for microbiome-host, and microbiome constituents' interaction and communication involves extracellular vesicles (EVs). Here, for the first time, we report the capability of two M. smithii strains (ALI and GRAZ-2), Candidatus M. intestini, and Methanosphaera stadtmanae, as underrepresented components of the gut microbiome, to produce EVs. Interesting, size, morphology, and composition of AEVs were comparable to bacterial EVs, as indicated by ultrastructure, composition, proteomic and metabolomic analyses; however, EVs were substantially less prevalent in the studied Archaea. When looking at the proteomics more precisely, although AEVs from M. smithii ALI and M. intestini were found to be carrying unique proteins (n=135 and n=30, respectively), the shared proteins in AEVs within this genus (n=229), were mostly adhesins(/like) proteins, or proteins with IG-like domains. One remarkable observation was the uptake of AEVs obtained from Methanosphaera stadtmanae and the studied Methanobrevibacter species by human monocytes and the subsequent IL-8 secretion.

Recent research provides new insights into the early establishment of the infant gut microbiome, emphasizing the influence of breastfeeding on the development of gastrointestinal (GIT) microbiomes. In our study, we longitudinally examined the taxonomic and functional dynamics of the oral and GIT microbiomes of healthy infants (n=30) in their first year, focusing on the often over-looked aspects, the development of archaeal and anaerobic microbiomes. Breastfed (BF) infants exhibit a more defined transitional phase in their oral microbiome compared to non-breastfed (NBF) infants, marked by a decrease in Streptococcus and the emergence of anaerobic genera such as Granulicatella. This phase, characterized by increased alpha diversity and significant changes in beta diversity, occurs earlier in NBF infants (months 1-3) than in BF infants (months 4-6), suggesting that breastfeeding supports later, more defined microbiome maturation. We demonstrated the presence of archaea in the infant oral cavity and GIT microbiome from early infancy, with Methanobrevibacter being the predominant genus. Still, transient patterns show that no stable archaeome is formed. The GIT microbiome exhibited gradual development, with BF infants showing increased diversity and complexity between months 3 and 8, marked by anaerobic microbial networks. NBF infants displayed complex microbial cooccurrence patterns from the start. Those strong differences between BF and NBF infants GIT microbiomes are less pronounced on functional levels than on taxonomic level. Overall, the infant microbiome differentiates and stabilizes over the first year, with breastfeeding playing a crucial role in shaping anaerobic microbial networks and overall microbiome maturation.