Abstract Earth’s life may have originated as self-replicating RNA. Some of the simplest current RNA replicators are RNA viruses, defined by linear RNA genomes encoding an RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), and subviral agents with single-stranded, circular RNA genomes, such as viroids encoding paired self-cleaving ribozymes. Amongst a massive expansion of candidate viroid and viroid-like elements, we report that fungal pathogens, ambiviruses, are viroid-like elements which undergo rolling circle replication and encode their own viral RdRP, thus they are a distinct hybrid infectious agent. These findings point to a deep evolutionary history between modern RNA viruses and sub-viral elements and offer new perspectives on the evolution of primordial infectious agents, and RNA life. One-Sentence Summary Novel infectious agents resembling self-cleaving viroid-like RNAs whilst encoding a viral RNA-dependent RNA polymerase.

Ribozymes are catalytic RNAs present in modern genomes but considered as remnants of a prebiotic RNA world. The paradigmatic hammerhead ribozyme (HHR) is a small self-cleaving motif widespread from bacterial to human genomes. Here, we report that most of the classical type I HHRs frequently found in the genomes of diverse animals are contained within a novel family of non-autonomous non-LTR retrotransposons. These retroelements are expressed as abundant linear and circular RNAs of ∼170-400 nt in different animal tissues. In vitro analyses confirm an efficient self-cleavage of the HHRs harboured in invertebrate retrozymes, whereas those in retrozymes of vertebrates, such as the axolotl, require to act as dimeric motifs to reach higher self-cleavage rates. Ligation assays of retrozyme RNAs with a protein ligase versus HHR self-ligation indicate that, most likely, tRNA ligases and not the ribozymes are involved in the step of RNA circularization. Altogether, these results confirm the existence of a new and conserved pathway in animals and, likely, in eukaryotes in general, for the efficient biosynthesis of RNA circles through small ribozymes, which will allow the development of biotechnological tools in the emerging field of circRNAs.

Abstract Small self-cleaving ribozymes are catalytic RNAs originally discovered in viroid-like agents, which are infectious circular RNAs (circRNAs) postulated as relics of a prebiotic RNA world. In the last decade, however, small ribozymes have also been detected across the tree of life, from bacterial to human genomes, and more recently, in viral agents with circRNA genomes. Here we report the conserved occurrence of small ribozymes within the linear genomes of typical ds and ssRNA viruses from fungi and plants. In most 5’-UTR regions of chrysovirids and fusarivirids, we find conserved type I hammerhead ribozymes (hhrbzs) showing efficient self-cleaving activity in vitro and in vivo . Similar hhrbzs, as well as hepatitis delta and twister ribozymes, were also detected in megabirna-, hypo-, fusagra- and toti-like viruses. These ribozymes occur as isolated motifs but also as close tandem pairs, suggesting that they are involved in the formation of ∼300 nt circRNAs. In vivo characterization of a chrysovirid hhrbz revealed its unexpected role in protein translation as an internal ribosome entry site (IRES). RNA structural comparison between the hammerhead three-way junction and the core domain of picornavirus IRES elements allow us to suggest that these simple ribozymes may follow a similar strategy to achieve cap-independent translation. We conclude that self-cleaving ribozymes, historically involved in the rolling circle replication of viroid-like agents, have been exapted towards translational functions in linear RNA viruses.