Abstract It is projected that, in 5 years, pancreatic cancer will become the second deadliest cancer in the United States. A unique aspect of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is its stroma; rich in cancer-associated fibroblasts (CAFs) and a dense CAF-generated extracellular matrix (ECM). This fibrous stroma, known as desmoplasia, causes the collapse of local blood vessels rendering a nutrient-deprived milieu. Hence, PDAC cells are nurtured by local CAF-secreted products, which include, among others, CAF-generated small extracellular vesicles (sEVs). It is well-accepted that upon culturing functionally tumor-promoting CAFs under pathophysiological-relevant conditions (e.g., within self-produced ECM), these cells express NetrinG1 (NetG1) and sustain endosomal pools rich in active α5β1-integrin; traits indicative of poor patient survival. We herein report that NetG1 + CAFs generate sEVs that rescue PDAC cells from nutrient-deprived induced apoptosis. Two unique sEVs, NetG1 + and α5β1-integrin + , were uncovered. The former constitutes cargo of CAF-generated exomeres, and the latter is detected in classic exosomes. Proteomic and metabolomic analyses showed that the sEV-dependent PDAC survival is, at least in part, dictated by the cargo packaged within sEVs in a NetG1-dependent manner. Indeed, despite producing a similar number of vesicles, selected key proteins and metabolites (e.g., glutamine) were incorporated within the unique sEVs. Finally, we found that NetG1 and α5β1-integrin were detected in sEVs collected from plasma of PDAC patients, while their concomitant levels were significantly lower in plasma of sex/age-matched healthy donors. The discovery of these tumor-supporting CAF sEVs opens a new investigative avenue in tumor-stroma interactions and stroma staging detection.

Abstract Understanding pancreatic cancer biology is fundamental for identifying new targets and for developing more effective therapies. In particular, the contribution of the stromal microenvironment to pancreatic cancer tumorigenesis requires further exploration. Here, we report the stromal roles of the synaptic protein Netrin G1 Ligand (NGL-1) in pancreatic cancer, uncovering its pro-tumor functions in cancer-associated fibroblasts and in immune cells. We observed that the stromal expression of NGL-1 inversely correlated with patients’ overall survival. Moreover, germline knockout (KO) mice for NGL-1 presented decreased tumor burden, with a microenvironment that is less supportive of tumor growth. Of note, tumors from NGL-1 KO mice produced less immunosuppressive cytokines and displayed an increased percentage of CD8 + T cells than those from control mice, while preserving the physical structure of the tumor microenvironment. These effects were shown to be mediated by NGL-1 in both immune cells and in the local stroma, in a TGF-β-dependent manner. While myeloid cells lacking NGL-1 decreased the production of immunosuppressive cytokines, NGL-1 KO T cells showed increased proliferation rates and overall polyfunctionality compared to control T cells. CAFs lacking NGL-1 were less immunosuppressive than controls, with overall decreased production of pro-tumor cytokines and compromised ability to inhibit CD8 + T cells activation. Mechanistically, these CAFs downregulated components of the TGF-β pathway, AP-1 and NFAT transcription factor families, resulting in a less tumor-supportive phenotype. Finally, targeting NGL-1 genetically or using a functionally antagonistic small peptide phenocopied the effects of chemotherapy, while modulating the immunosuppressive tumor microenvironment (TME), rather than eliminating it. We propose NGL-1 as a new local stroma and immunomodulatory molecule, with pro-tumor roles in pancreatic cancer. Statement of Significance Here we uncovered the pro-tumor roles of the synaptic protein NGL-1 in the tumor microenvironment of pancreatic cancer, defining a new target that simultaneously modulates tumor cell, fibroblast, and immune cell functions. This study reports a new pathway where NGL-1 controls TGF-β, AP-1 transcription factor members and NFAT1, modulating the immunosuppressive microenvironment in pancreatic cancer. Our findings highlight NGL-1 as a new stromal immunomodulator in pancreatic cancer.

Abstract In pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the fibroblastic stroma constitutes most of the tumor mass and is remarkably devoid of functional blood vessels. This raises an unresolved question of how PDAC cells obtain essential metabolites and water-insoluble lipids. We have found a critical role for cancer-associated fibroblasts (CAFs) in obtaining and transferring lipids from blood-borne particles to PDAC cells via trogocytosis of CAF plasma membranes. We have also determined that CAF-expressed phospholipid scramblase anoctamin 6 (ANO6) is an essential CAF trogocytosis regulator required to promote PDAC cell survival. During trogocytosis, cancer cells and CAFs form synapse-like plasma membranes contacts that induce cytosolic calcium influx in CAFs via Orai channels. This influx activates ANO6 and results in phosphatidylserine exposure on CAF plasma membrane initiating trogocytosis and transfer of membrane lipids, including cholesterol, to PDAC cells. Importantly, ANO6-dependent trogocytosis also supports the immunosuppressive function of pancreatic CAFs towards cytotoxic T cells by promoting transfer of excessive amounts of cholesterol. Further, blockade of ANO6 antagonizes tumor growth via disruption of delivery of exogenous cholesterol to cancer cells and reverses immune suppression suggesting a potential new strategy for PDAC therapy.