Abstract The OsCPK4 gene is a member of the complex gene family of calcium-dependent protein kinases in rice (Oryza sativa). Here, we report that OsCPK4 expression is induced by high salinity, drought, and the phytohormone abscisic acid. Moreover, a plasma membrane localization of OsCPK4 was observed by transient expression assays of green fluorescent protein-tagged OsCPK4 in onion (Allium cepa) epidermal cells. Overexpression of OsCPK4 in rice plants significantly enhances tolerance to salt and drought stress. Knockdown rice plants, however, are severely impaired in growth and development. Compared with control plants, OsCPK4 overexpressor plants exhibit stronger water-holding capability and reduced levels of membrane lipid peroxidation and electrolyte leakage under drought or salt stress conditions. Also, salt-treated OsCPK4 seedlings accumulate less Na+ in their roots. We carried out microarray analysis of transgenic rice overexpressing OsCPK4 and found that overexpression of OsCPK4 has a low impact on the rice transcriptome. Moreover, no genes were found to be commonly regulated by OsCPK4 in roots and leaves of rice plants. A significant number of genes involved in lipid metabolism and protection against oxidative stress appear to be up-regulated by OsCPK4 in roots of overexpressor plants. Meanwhile, OsCPK4 overexpression has no effect on the expression of well-characterized abiotic stress-associated transcriptional regulatory networks (i.e. ORYZA SATIVA DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN1 and ORYZA SATIVA No Apical Meristem, Arabidopsis Transcription Activation Factor1-2, Cup-Shaped Cotyledon6 genes) and LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT genes in their roots. Taken together, our data show that OsCPK4 functions as a positive regulator of the salt and drought stress responses in rice via the protection of cellular membranes from stress-induced oxidative damage.

ABSTRACT Plant small RNAs are a diverse and complex set of molecules, ranging in length from 21 to 24 nt, involved in a wide range of essential biological processes. High-throughput sequencing is used for the discovery and quantification of small RNAs. However, several biases can occur during the preparation of small RNA libraries, especially using low input RNA. We used two stages of maize anthers to evaluate the performance of seven commercially-available methods for small RNA library construction, using different RNA input amounts. We show that when working with plant material, library construction methods have differing capabilities to capture small RNAs, and that different library construction methods provide better results when applied to the detection of microRNAs, phasiRNAs, or tRNA-derived fragment. We also observed that ligation bias occurs at both ends of miRNAs and phasiRNAs, suggesting that the biased compositions observed in small RNA populations, including nonstoichiometric levels of phasiRNAs within a locus, may reflect a combination of biological and technical influences.

ABSTRACT The Solanaceae or “nightshade” family is an economically important group that harbors a remarkable amount of diversity. To gain a better understanding of how the unique biology of the Solanaceae relates to the family’s small RNA genomic landscape, we downloaded over 255 publicly available small RNA datasets that comprise over 2.6 billion reads of sequence data. We applied a suite of computational tools to predict and annotate two major small RNA classes: (1) microRNAs (miRNAs), typically 20-22 nt RNAs generated from a hairpin precursor and functioning in gene silencing, and (2) short interfering RNAs (siRNAs), including 24-nt heterochromatic siRNAs (hc-siRNAs) typically functioning to repress repetitive regions of the genome via RNA-directed DNA methylation, as well as secondary phased siRNAs (phasiRNAs) and trans-acting siRNAs (tasiRNAs) generated via miRNA-directed cleavage of a Pol II-derived RNA precursor. Our analyses described thousands of small RNA loci, including poorly-understood clusters of 22-nt siRNAs that accumulate during viral infection. The birth, death, expansion, and contraction of these small RNA loci are dynamic evolutionary processes that characterize the Solanaceae family. These analyses indicate that individuals within the same genus share similar small RNA landscapes, whereas comparisons between distinct genera within the Solanaceae reveal relatively few commonalities. ONE-SENTENCE SUMMARY We use over 255 publicly-available small RNA datasets to characterize the small RNA landscape for the Solanaceae family.

ABSTRACT Previously, we have shown that apoplastic wash fluid purified from Arabidopsis leaves contains small RNAs (sRNAs). To investigate whether these sRNAs are encapsulated inside extracellular vesicles (EVs), we treated EVs isolated from Arabidopsis leaves with the protease trypsin and RNase A, which should degrade RNAs located outside EVs but not those located inside. These analyses revealed that apoplastic RNAs are mostly located outside EVs and are associated with proteins. Further analyses of these extracellular RNAs (exRNAs) revealed that they comprise both sRNAs and long non-coding RNAs (lncRNAs), including circular RNAs (circRNAs). We also found that exRNAs are highly enriched in the post-transcriptional modification N 6 -methyladenine (m 6 A). Consistent with this, we identified a putative m 6 A-binding protein in apoplastic wash fluid, GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN 7 (GRP7), as well as the small RNA-binding protein ARGONAUTE2 (AGO2). These two proteins co-immunoprecipitated with each other, and with lncRNAs, including circRNAs. Mutation of GRP7 or AGO2 caused changes in both the sRNA and lncRNA content of apoplastic wash fluid, suggesting that these proteins contribute to the secretion and/or stabilization of exRNAs. We propose that these extravesicular RNAs mediate host-induced gene silencing, rather than RNA inside EVs. One-sentence summary The apoplast of Arabidopsis leaves contains diverse small and long-noncoding RNAs, including circular RNAs, that are bound to protein complexes and are located outside extracellular vesicles.

SUMMARY Microspore embryogenesis is a model for developmental plasticity and cell fate decisions. To investigate the role of miRNAs in this development, we sequenced sRNAs and the degradome of barley microspores collected prior to (day 0) and after (days 2 and 5) the application of a stress treatment known to induce embryogenesis. Microspores isolated at these timepoints were uniform in both appearance and in their complements of sRNAs. We detected 68 miRNAs in microspores. The abundance of 51 of these miRNAs differed significantly during microspore development. One group of miRNAs was induced when the stress treatment was applied, prior to being repressed when microspores transitioned to embryogenesis. Another group of miRNAs were up-regulated in day-2 microspores and their abundance remained stable or increased in day-5 microspores, a timepoint at which the first clear indications of the transition towards embryogenesis were visible. Collectively, these miRNAs might play a role in the modulation of the stress response, the repression of gametic development, and/or the gain of embryogenic potential. A degradome analysis allowed us to validate the role of miRNAs in regulating 41 specific transcripts. We showed that the transition of microspores toward the embryogenesis pathway involves miRNA-directed regulation of members of the ARF, SPL, GRF and HD-ZIPIII transcription factor families. We noted that 41.5% of these targets were shared between day-2 and day-5 microspores while 26.8% were unique to day-5 microspores. The former set may act to disrupt transcripts involved in pollen development while the latter set may drive the commitment to embryogenesis.

Abstract After having co-existed in plant genomes for at least 200 million years, the products of microRNA (miRNA) and Nucleotide-Binding Leucine Rich Repeat protein (NLR) genes formed a regulatory relationship in the common ancestor of modern gymnosperms and angiosperms. From then on, DNA polymorphisms occurring at miRNA target sequences within NLR transcripts must have been compensated by mutations in the corresponding mature miRNA sequence, therefore maintaining that regulatory relationship. The potential evolutionary advantage of such regulation remains largely unknown and might be related to two mutually non-exclusive scenarios: miRNA-dependent regulation of NLR levels might prevent defence mis-activation with negative effects on plant growth and reproduction; or reduction of active miRNA levels in response to pathogen derived molecules (PAMPS and silencing suppressors) might rapidly release otherwise silent NLR transcripts for rapid translation and thereby enhance defence. Here, we used Arabidopsis thaliana plants deficient for miR472 function to study the impact of releasing its NLR targets on plant growth and reproduction and on defence against the fungal pathogen Plectospharaella cucumerina . We show that miR472 regulation has a dual role, participating both in the tight regulation of plant defence and growth. MIM472 lines, with reduced active miR472, are more resistant to pathogens and, correlatively, have reduced relative growth compared to wild-type plants. However, despite MIM472 lines flower at the same time than their wild-type, the end of their reproductive phase is delayed, and they exhibit higher adult biomass, resulting in similar seed yield as the wild-type. Our study highlights how negative consequences of defence activation might be compensated by changes in phenology and that miR472 reduction is an integral part of plant defence responses.

Abstract Hybrid breeding for increased vigor has been used for over a century to boost agricultural outputs without requiring higher inputs. While this approach has led to some of the most substantial gains in crop productivity, breeding barriers have fundamentally limited soybean ( Glycine max ) from reaping the benefits of hybrid vigor. Soybean makes inconspicuous flowers that self-fertilize before opening, and thus are not readily amenable to outcrossing. In this study, we demonstrate that the Barnase/Barstar male sterility/male rescue system can be used in soybean to produce hybrid seeds. By expressing the cytotoxic ribonuclease, Barnase, under a tapetum-specific promoter in soybean anthers, we are able to completely block pollen maturation, creating male-sterile plants. We show that fertility can be rescued in the F1 generation of these Barnase-expressing lines when they are crossed with pollen from plants that express the Barnase inhibitor, Barstar. Importantly, we found that the successful rescue of male fertility is dependent on the relative dosage of Barnase and Barstar. When Barnase and Barstar were expressed under the same tapetum-specific promoter, the F1 offspring remained male-sterile. When we expressed Barstar under a relatively stronger promoter than Barnase, we were able to achieve a successful rescue of male fertility in the F1 generation. This work demonstrates the successful implementation of a biotechnology approach to produce fertile hybrid offspring in soybean.

Abstract RNA silencing is a conserved mechanism in eukaryotes and is involved in development, heterochromatin maintenance and defense against viruses. In plants, ARGONAUTE1 (AGO1) protein plays a central role in both microRNA (miRNA) and small interfering RNA (siRNA)-directed silencing and its expression is regulated at multiple levels. Here, we report that the F-box protein FBW2 targets proteolysis of AGO1 by a CDC48-mediated mechanism. We found that FBW2 assembles an SCF complex that recognizes the MID-PIWI domain of AGO1 and requires its C-terminal domain containing a GW motif for AGO1 turnover. We showed that FBW2 prefers the unloaded and some mutated forms of AGO1 protein. While FBW2 loss of function does not lead to strong growth or developmental defects, it significantly increases RNA silencing activity. Interestingly, under conditions in which small RNA production or accumulation is affected, the failure to degrade AGO1 in fbw2 mutants becomes more deleterious for the plant. Hence, the non-degradable AGO1 protein assembles high molecular weight complexes and binds illegitimate small RNA leading to the cleavage of new target genes that belong to stress responses and cellular metabolic processes. Therefore, the control of AGO1 homeostasis by ubiquitin ligases plays an important role in quality control to avoid off-target cleavage.

Summary Non-coding and coding RNAs are key regulators of plant growth, development, and stress responses. To investigate the types of transcripts accumulated during the vegetative to reproductive transition and floral development in the Coffea arabica L., we sequenced small RNA libraries from eight developmental stages, up to anthesis. We combined this data with messenger RNA and PARE sequencing of two important development stages that marks the transition of an apparent latent to a rapid growth stage. In addition, we took advantage of multiple in silico tools to characterize genomic loci producing small RNAs such as phasiRNAs, miRNAs and tRFs. Our differential and co-expression analysis showed that some types of small RNAs such as tRNAs, snoRNAs, snRNAs and phasiRNAs preferentially accumulate in a stage- specific manner. Members of the miR482/miR2118 superfamily and their 21-nucleotide phasiRNAs originating from resistance genes show a robust co-expression pattern that is maintained across all the evaluated developmental stages. Finally, the majority of miRNAs accumulate in a family-stage specific manner, related to modulated hormonal responses and transcription factors expression. Societal Impact Statement This research holds potential to benefit millions of coffee-producing families in over 60 countries. We uncovered molecular regulatory mechanisms governing flower development, one of the causes for the Coffea arabica ’s uneven ripening. The absence of uniformity in coffee production, spanning from floral induction to branch senescence, has a detrimental impact on the final product’s quality. These insights will inform strategies for controlled coffee maturation, leading to improved, uniform harvests.

After having co-existed in plant genomes for at least 200 million years, the products of microRNA (miRNA) and Nucleotide-Binding Leucine Rich Repeat protein (NLR) genes formed a regulatory relationship in the common ancestor of modern gymnosperms and angiosperms. From then on, DNA polymorphisms occurring at miRNA target sequences within NLR transcripts must have been compensated by mutations in the corresponding mature miRNA sequence. The potential evolutionary advantage of such regulation remains largely unknown and might be related to two non-exclusive scenarios: miRNA-dependent regulation of NLR levels might prevent defense mis-activation with negative effects on plant growth and reproduction; or reduction of active miRNA levels in response to pathogen derived molecules (PAMPS and silencing suppressors) might rapidly release otherwise silent NLR transcripts for rapid translation and thereby enhance defense. Here, we used Arabidopsis thaliana plants deficient for miR472 function to study the impact of releasing its NLR targets on plant growth and reproduction and on defense against the fungal pathogen Plectospharaella cucumerina. We show that miR472 regulation has a dual role, participating both in the tight regulation of plant defense and growth. MIM472 lines, with reduced active miR472, are more resistant to pathogens and, correlatively, have reduced relative growth compared to wild-type plants although the end of their reproductive phase is delayed, exhibiting higher adult biomass and similar seed yield as the wild-type. Our study highlights how negative consequences of defense activation might be compensated by changes in phenology and that miR472 reduction is an integral part of plant defense responses.