Interleukin-6 (IL-6) is a cytokine that can bind to IL-6 receptor and induce pleiotropic effects. It serves as a critical biomarker, involved in inflammation amplification, tumor progression, and many other disease developments. Nanobodies, featuring small structure and high affinity, are a powerful and versatile tool in medical diagnostics and therapeutics. Here, based on a scaffold optimized for humanization and stability, we developed a synthetic phage display library that rapidly generated high-affinity and humanized nanobodies, negating the need for animal immunization. Using enhanced green fluorescent protein (eGFP) as a benchmark, we demonstrated that the library produced humanized nanobodies with high function and great intracellular stability. The library was then subjected to screening against IL-6. We identified a standout nanobody, NbL3, which exhibited high affinity (22.16 nM) and stability and significantly inhibited IL-6-enhanced migration on the human breast cancer cell MCF-7 at a relatively low concentration. NbL3’s strong blocking activity provides a promising therapeutic alternative for the IL-6-targeted intervention strategy, underscoring the broader potential of our synthetic library as a versatile platform for the development of humanized nanobodies against multiple antigens.

Optical tissue clearing and three-dimensional (3D) immunofluorescence (IF) microscopy have been transforming imaging of the complex tumor microenvironment (TME). However, current 3D IF microscopy has restricted multiplexity; only three or four cellular and non-cellular TME components can be localized in a cleared tumor tissue. Here we report a LED photobleaching method and its application for 3D multiplexed optical mapping of the TME. We built a high-power LED light irradiation device and temperature-controlled chamber for completely bleaching fluorescent signals throughout optically cleared tumor tissues without compromise of tissue and protein antigen integrity. With newly developed tissue mounting and selected region-tracking methods, we established a cyclic workflow involving IF staining, tissue clearing, 3D confocal microscopy, and LED photobleaching. By registering microscope channel images generated through three work cycles, we produced 8-plex image data from individual 400 μm-thick tumor macrosections that visualize various vascular, immune, and cancer cells in the same TME at tissue-wide and cellular levels in 3D. Our method was also validated for quantitative 3D spatial analysis of cellular remodeling in the TME after immunotherapy. These results demonstrate that our LED photobleaching system and its workflow offer a novel approach to increase the multiplexing power of 3D IF microscopy for studying tumor heterogeneity and response to therapy.

Three-dimensional (3D) optical microscopy, combined with advanced tissue clearing, permits

Src family kinases (SFKs), including Src, Fyn and Yes, play important roles in development and cancer. Despite being first discovered as the Y es- a ssociated p rotein, the regulation of Yap by SFKs remains poorly understood. Here, through single-cell analysis and genetic lineage tracing, we show that the pan-epithelial ablation of C-terminal Src kinase (Csk) in the lacrimal gland unleashes broad Src signaling but specifically causes extrusion and apoptosis of acinar progenitors at a time when they are shielded by myoepithelial cells from the basement membrane.