Abstract Assessing female fish reproductive success requires a thorough evaluation of egg characteristics, including egg number, size and variability as well as egg developmental potential through the monitoring of embryo survival after fertilization. While embryonic success relies, at least in part, on paternal contribution, some parameters are strictly related to egg characteristics, one of the main ones being the viability of the egg when released into the water at spawning. It is however not necessarily possible, at least in salmonid fish that lay non-transparent eggs, to separate the different causes of egg/embryo failure. In this context, our aim was i) to develop a simple and rapid system to capture images of rainbow trout eggs combined with computerized processing of these images to perform a fully automatic individual characterization of egg features including number and size ii) to estimate unfertilized egg viability through the monitoring of the percentage of eggs that will not survive to water hydration. To evaluate the VisEgg system, unfertilized eggs (approximatively 400 eggs per batch) originating from 105 different females were hydrated in water. After 24h, a picture of the eggs was obtained using a dedicated shooting system consisting of a light source and a digital single-lens reflex (SLR) camera. An image processing algorithm was developed to allow the automatic detection and separation of the eggs and to perform automatic measurements of egg number and individual egg size. The presence of white egg was used as an indirect measure of egg integrity, the “whitening” being the result of water entry into the egg through the vitelline membrane. These white eggs were therefore considered as non-viable, as a result of their lack of physical integrity. Fertilization assays were performed in parallel using a subsample of the same egg batch. Embryonic development was monitored and hatching rate was calculated. A significant correlation between white egg percentage after hydration and hatching rate was observed (Spearman coefficient =-0.557, p<0.001), in consistency with the fact that non-viable egg will not allow successful embryonic development. In contrast, the percentage of eggs that do not successfully hatched includes egg/embryo failures of different nature including egg viability, their capacity to be fertilized and to develop into an embryo. Using VisEgg, we were able to quantify the lack of viability of the eggs separately from the different other events that may occur during fertilization and incubation. VisEgg is a convenient and reliable tool to obtain individuals measures on trout eggs. It can be used to assess not only egg size and egg number but also unfertilized egg viability before fertilization.

Abstract Background Selective breeding is a promising solution to reduce fish farms vulnerability to heat peaks which intensity and frequency are predicted to increase due to climate change. However, limited information about the genetic architecture of acute hyperthermia resistance in fish is available. Two batches of sibs from a rainbow trout commercial line were produced. The first batch (N=1,382) was phenotyped for acute hyperthermia resistance at nine months, and the second batch (N=1,506) was phenotyped for main production traits (growth, body length, muscle fat content and carcass yield) at twenty months. Fish were genotyped on a 57K SNP array, and their genotypes were imputed at high-density thanks to their parents being genotyped on a 665K SNP array. Results The heritability estimate of resistance to acute hyperthermia in juveniles was 0.29 ± 0.05, confirming the potential of selective breeding for this trait. Genetic correlations between acute hyperthermia resistance and main production traits at near harvest age were all close to zero. Hence, selecting for acute hyperthermia resistance should not impact the main production traits, and reversely. The genome-wide association study revealed that resistance to acute hyperthermia is highly polygenic; altogether, the six detected QTL explained less than 5% of the genetic variance. Two of these QTL, including the most significant one, might explain acute hyperthermia resistance differences across INRAE isogenic lines of rainbow trout. The phenotypic mean differences between homozygotes at peak SNP were up to 69% of the phenotypic standard deviation, showing promising potential for marker-assisted selection. We identified 89 candidate genes within the six QTL regions, among which the most convincing functional candidate genes were dnajc7 , hsp70b , nkiras2 , cdk12 , phb , fkbp10 , ddx5 , cygb1 , enpp7 , pdhx and acly . Conclusions This study provides valuable insight on the genetic architecture of acute hyperthermia resistance in juvenile rainbow trout. The potential for the selective breeding of this trait was shown to be substantial and should not interfere with selection for main production traits. Identified functional candidate genes give a new insight on physiological mechanisms involved in acute hyperthermia resistance, such as protein chaperoning, oxidative stress response, homeostasis maintenance and cell survival.

Deciphering mechanisms of oocyte development in female fishes still remains challenging and a comprehensive overview of this process at the level of the organ is still needed. The recent development optical tissue clearing methods have tremendously boosted the 3D imaging of large size biological samples that are naturally opaque. However, no attempt of clearing on fish ovary that accumulates extremely high concentration of lipids within oocytes has been reported to date. To face with this ovarian-specific challenge, we combined two existing clearing methods, the non-toxic solvent-based Eci method for efficient clearing and the CUBIC method to enhance lipid removal and reduce non-specific staining. The methyl green fluorescent dye was used to stain nuclei and delineate follicles. Using this procedure (named C-Eci), ovaries of both medaka and trout could be imaged in 3D and all follicles analyzed. To our knowledge this is the first procedure elaborated for clearing and imaging fish ovary in 3D. The C-Eci methods thus provides an interesting tool for getting precise quantitative data on follicular content in fish ovary and promises to be useful for further morphological studies.

The comprehension of muscle tissue formation and regeneration is essential to develop therapeutic approaches against muscle diseases or loss in muscle mass and strength during ageing or cancer. One of the critical steps in muscle formation is the fusion of muscle cells to form or regenerate muscle fibres. To identify new genes controlling myoblast fusion, we undertook an siRNA screen in c2c12 myoblasts and found that N-alpha-acetyltransferase 15 (Naa15) knockdown enhanced c2c12 myoblast fusion suggesting that Naa15 negatively regulated myogenic cell fusion. We identified two Naa15 orthologous genes in zebrafish genome: naa15a and naa15b. These two orthologs are both expressed in myogenic domain of the somite. Knockdown of zebrafish naa15a and naa15b genes induced a U shaped segmentation of the myotome and alteration of myotome boundaries resulting in the formation of abnormally long myofibres spanning adjacent somites. Taken together these results show that Naa15 regulates myotome formation and myogenesis in fish.

The dramatic increase in myotomal muscle mass in post-hatching fish is related to their ability to lastingly produce new muscle fibres, a process termed hyperplasia. The molecular and cellular mechanisms underlying fish muscle hyperplasia largely remain unknown. In this study, we aimed to characterize intrinsic properties of myogenic cells originating from fish hyperplasic muscle. For this purpose, we compared in situ proliferation, in vitro cell behavior and transcriptomic profile of myogenic precursors originating from hyperplasic muscle of juvenile trout (JT) and from non-hyperplasic muscle of fasted juvenile trout (FJT) and adult trout (AT). For the first time, we showed that myogenic precursors proliferate in hyperplasic muscle from JT as shown by in vivo BrdU labeling. This proliferative rate was very low in AT and FJT muscle. Transcriptiomic analysis revealed that myogenic cells from FJT and AT displayed close expression profiles with only 64 differentially expressed genes (BH corrected p-val < 0.001). In contrast, 2623 differentially expressed genes were found between myogenic cells from JT and from both FJT and AT. Functional categories related to translation, mitochondrial activity, cell cycle, and myogenic differentiation were inferred from genes up regulated in JT compared to AT and FJT myogenic cells. Conversely, Notch signaling pathway, that signs cell quiescence, was inferred from genes down regulated in JT compared to FJT and AT. In line with our transcriptomic data, in vitro JT myogenic precursors displayed higher proliferation and differentiation capacities than FJT and AT myogenic precursors. The transcriptomic analysis and examination of cell behavior converge to support the view that myogenic cells extracted from hyperplastic muscle of juvenile trout are intrinsically more potent to form myofibres than myogenic cells extracted from non-hyperplasic muscle. The generation of gene expression profiles in myogenic cell extracted from muscle of juvenile trout may yield insights into the molecular and cellular mechanisms controlling hyperplasia and provides a useful list of potential molecular markers of hyperplasia.

Female gamete production relies on coordinated molecular and cellular processes that occur in the ovary throughout oogenesis. In fish, as in other vertebrates, these processes have been extensively studied both in terms of endocrine/paracrine regulation and protein expression and activity. The role of small non-coding RNAs in the regulation of animal reproduction remains however largely unknown and poorly investigated, despite a growing interest for the importance of miRNAs in a wide variety of biological processes. Here, we analyzed the role of miR-202, a miRNA predominantly expressed in male and female gonads in several vertebrate species. We studied its expression in the medaka ovary and generated a mutant line (using CRISPR/Cas9 genome engineering) to determine its importance for reproductive success with special interest for egg production. Our results show that miR-202-5p is the biologically active form of the miRNA and that it is expressed in granulosa cells and in the unfertilized egg. The knock out (KO) of miR-202 resulted in a strong phenotype both in terms of number and quality of eggs produced. Mutant females exhibited either no egg production or produced a drastically reduced number of eggs that could not be fertilized, ultimately leading to no reproductive success. We quantified the size distribution of the oocytes in the ovary of KO females and performed a genome-wide transcriptomic analysis approach to identified dysregulated molecular pathways. Together, cellular and molecular analyses indicate that lack of miR-202 impairs the early steps of oogenesis/folliculogenesis and decreases the number of large (i.e. vitellogenic) follicles, ultimately leading to dramatically reduced female fecundity. This study sheds new light on the regulatory mechanisms that control the early steps of follicular development and provides the first in vivo functional evidence that an ovarian-predominant microRNA may have a major role in female reproduction.

Abstract Arachidonic acid (C20: 4n-6, AA) plays a fundamental role in fish physiology, influencing growth, survival and stress resistance. However, imbalances in dietary AA can have detrimental effects on fish health and performance. Optimal AA requirements for rainbow trout have not been established. This study aimed to elucidate the effects of varying dietary AA levels on survival, growth, long-chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) biosynthetic capacity, oxylipin profiles, lipid peroxidation, and stress resistance of rainbow trout fry. Over a period of eight weeks, 4000 female rainbow trout fry at the resorptive stage (0.12 g) from their first feeding were fed diets with varying levels of AA (0.6%, 1.1% or 2.5% of total fatty acids) while survival and growth metrics were closely monitored. The dietary trial was followed by an acute confinement stress test. Notably, while the fatty acid profiles of the fish reflected dietary intake, those fed an AA-0.6% diet showed increased expression of elongase5, highlighting their inherent ability to produce LC-PUFAs from C18 PUFAs and suggesting potential AA or docosapentaenoic acid n-6 (DPA n-6 ) biosynthesis. However, even with this biosynthetic capacity, the trout fed reduced dietary AA had higher mortality rates. The diet had no effect on final weight (3.38 g on average for the three diets). Conversely, increased dietary AA enhanced eicosanoid production from AA, suggesting potential inflammatory and oxidative consequences. This was further evidenced by an increase in non-enzymatic lipid oxidation metabolites, particularly in the AA-2.5% diet group, which had higher levels of phytoprostanes and isoprostanes, markers of cellular oxidative damage. Importantly, the AA-1.1% diet proved to be particularly beneficial for stress resilience. This was evidenced by higher post-stress turnover rates of serotonin and dopamine, neurotransmitters central to the fish's stress response. In conclusion, a dietary AA intake of 1.1% of total fatty acids appears to promote overall resilience in rainbow trout fry.

Abstract Interactions between tissues and cell types, mediated by cytokines or direct cell-cell exchanges, regulate growth. To determine whether mature adipocytes influence the in vitro development of trout mononucleated muscle cells, we developed an indirect coculture system, and showed that adipocytes (5×10 6 cells/well) derived from perivisceral adipose tissue increased the proliferation (BrdU + ) of the mononucleated muscle cells (26% versus 39%; P<0.001) while inhibiting myogenic differentiation (myosin + ) (25% versus 15%; P<0.001). Similar effects were obtained with subcutaneous adipose tissue-derived adipocytes, although requiring more adipocytes (3×10 7 cells/well versus 5×10 6 cells/well). Conditioned media recapitulated these effects, stimulating proliferation (31% versus 39%; p<0.001) and inhibiting myogenic differentiation (32% versus 23%; p<0.001). Adipocytes began to reduce differentiation after 24 hours, whereas proliferation stimulation was observed after 48 hours. While adipocytes did not change pax7 + and myoD1/2 + percentages, they reduced myogenin + cells showing inhibition from early differentiation stage. Finally, adipocytes increased BrdU + cells in the Pdgfrα + population but not in the myoD + one. Collectively, our results demonstrate that trout adipocytes promote fibro-adipocyte precursor proliferation while inhibiting myogenic cells differentiation in vitro , suggesting the key role of adipose tissue in regulating fish muscle growth.

ABSTRACT Computational analysis of bio-images by deep learning (DL) algorithms has made exceptional progress in recent years and has become much more accessible to non-specialists with the development of ready-to-use tools. The study of oogenesis mechanisms and female reproductive success in fish has also recently benefited from the development of efficient three-dimensional (3D) imaging protocols on entire ovaries. Such large datasets have a great potential for the generation of new quantitative data on oogenesis but are, however, complex to analyze due to imperfect fluorescent signals and the lack of efficient image analysis workflows. Here, we applied two open-source DL tools, Noise2Void and Cellpose, to analyze the oocyte content of medaka ovaries at larvae and adult stages. These tools were integrated into end-to-end analysis pipelines that include image pre-processing, cell segmentation, and image post-processing to filter and combine labels. Our pipelines thus provide effective solutions to accurately segment complex 3D images of entire ovaries with either irregular fluorescent staining or low autofluorescence signal. In the future, these pipelines will be applicable to extensive cellular phenotyping in fish for developmental or toxicology studies. Summary statement An accessible image analysis method for biologists, which includes easy-to-use deep learning algorithms, designed for accurate quantitative measurement of ovarian content from complex 3D fluorescent images.

ABSTRACT Supplementing a fishmeal-free diet with yeast extract improves rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss ) growth performance and modulates the hepatic and intestinal transcriptomic response. These effects are often observed in the long term, but are not well documented after short periods of fasting. Fasting for a few days is a common practice in fish farming, especially before handling the fish, such as for short sorting, tank transfers and vaccinations. In the present study, rainbow trout were subjected to a four-day fast and then refed, for eight days, a conventional diet containing fishmeal (control diet) or alternative diets composed of terrestrial animal by-products supplemented or not with a yeast extract. During the refeeding period alone, most of the parameters considered did not differ significantly in response to the different feeds. Only the expression of claudin-15 was upregulated in fish fed the yeast-supplemented diet compared to the control diet. Conversely, fasting followed by refeeding significantly influenced most of the parameters analyzed. In the proximal intestine, the surface area of villi significantly increased and the density of goblet cell tended to decrease during refeeding. Although no distinct plasma immune response or major signs of gut inflammation were observed, some genes involved in the structure, complement pathway, antiviral functions, coagulation and endoplasmic reticulum stress response of the liver and intestine were significantly regulated by refeeding after fasting. These results indicate that short-term fasting, as commonly practiced in fish farming, significantly alters the physiology of the liver and intestine regardless of the composition of the diet.