Abstract Nuclear RNA binding proteins (RBPs) are difficult to study because they often belong to large protein families and form extensive networks of auto- and cross- regulation. They are highly abundant and often localize to condensates with a slow turnover, requiring long depletion times or knockouts that cannot distinguish between direct and indirect or compensatory effects. Here, we developed a system that is optimized for the rapid degradation of nuclear RBPs, called hGRAD. It comes as a ʹone-fits-allʹ plasmid, and integration into any cell line that expresses endogenously GFP-tagged proteins allows an inducible, rapid and complete knockdown. We show that the nuclear RBPs SRSF3, SRSF5, SRRM2 and NONO are completely cleared from nuclear speckles and paraspeckles within two hours. hGRAD works in various cell types, is more efficient than other methods and does not require the expression of exogenous ubiquitin ligases. Combining SRSF5 hGRAD degradation with Nascent-seq uncovered highly dynamic transient transcript changes, compensatory mechanisms and that SRSF5 promotes transcript stability.

This laboratory has previously shown that nuclear import of CaMV P6 is required for infection and suppression of the RNA silencing factor DRB4. EMBO J., 27:2102 - 2112. In the original paper, there were inadvertent errors in the mounting of a figure. We have now repeated the experiments concerned, using the seed stock of the corresponding transgenic plants. The results presented here confirm those reported in the original paper. The plants expressing P6 are strongly stunted with chlorotic and serrated leaves. Conversely, the transgenic expression of various P6 mutant alleles do not induce this phenotype.

Abstract Global warming poses a threat for crops, therefore, the identification of thermotolerance mechanisms is a priority. In plants, the core factors that regulate transcription under heat stress (HS) are well described and include several HS transcription factors (HSFs). Despite the relevance of alternative splicing in HS response and thermotolerance, the core regulators of HS-sensitive alternative splicing have not been identified. In tomato, alternative splicing of HSFA2 is important for acclimation to HS. Here, we show that several members of the serine/arginine-rich family of splicing factors (SRSFs) suppress HSFA2 intron splicing. Individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) combined with RNA-Seq revealed that RS2Z35 and RS2Z36, which make up a plant-specific clade of SR proteins, not only regulate HSFA2 but approximately 50% of RNAs that undergo HS-sensitive alternative splicing, with preferential binding to purine-rich RNA motifs. Single and double CRISPR rs2z mutant lines show a dysregulation of splicing and exhibit lower basal and acquired thermotolerance compared to wild type plants. Our results suggest that RS2Z35 and RS2Z36 have a central role in mitigation of the negative effects of HS on RNA splicing homeostasis, and their emergence might have contributed to the increased capacity of plants to acclimate to high temperatures.

Abstract High temperatures cause heat stress (HS), which has negative effects on plant growth and development and affects many cellular processes including pre-mRNA splicing. In tomato plants the splicing profile of many of genes is altered under HS, including that of HSFA2 , a central transcriptional regulator of thermotolerance. To identify the core splicing regulators of HS-sensitive alternative splicing, we used HSFA2 as bait and identified two plant-specific members of the serine/arginine-rich family of splicing factors, namely RS2Z35 and RS2Z36, that inhibit HSFA2 intron splicing. Single and double CRISPR mutants of these proteins show dysregulated splicing of many genes and exhibit lower basal and acquired thermotolerance. Individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) of tomato leaves revealed that the majority of HS-sensitive alternatively spliced RNAs are bound by RS2Z35 and RS2Z36 and this interaction occurs at purine-rich RNA motifs. Phenotypic and transcriptome analyses revealed that RS2Z35 and RS2Z36 are important players in the stress response and thermotolerance in plants that mitigate the negative effects of HS on RNA splicing homeostasis.

RNA splicing enables the functional adaptation of cells to changing contexts. Impaired splicing has been associated with diseases, including retinitis pigmentosa, but the underlying molecular mechanisms and cellular responses remain poorly understood. In this work, we report that deficiency of ubiquitin-specific protease 39 (USP39) in human cell lines, zebrafish larvae, and mice led to impaired spliceosome assembly and a cytotoxic splicing profile characterized by the use of cryptic 5′ splice sites. Disruptive cryptic variants evaded messenger RNA (mRNA) surveillance pathways and were translated into misfolded proteins, which caused proteotoxic aggregates, endoplasmic reticulum (ER) stress, and, ultimately, cell death. The detrimental consequence of splicing-induced proteotoxicity could be mitigated by up-regulating the ubiquitin-proteasome system and selective autophagy. Our findings provide insight into the molecular pathogenesis of spliceosome-associated diseases.