Abstract Global warming poses a threat for crops, therefore, the identification of thermotolerance mechanisms is a priority. In plants, the core factors that regulate transcription under heat stress (HS) are well described and include several HS transcription factors (HSFs). Despite the relevance of alternative splicing in HS response and thermotolerance, the core regulators of HS-sensitive alternative splicing have not been identified. In tomato, alternative splicing of HSFA2 is important for acclimation to HS. Here, we show that several members of the serine/arginine-rich family of splicing factors (SRSFs) suppress HSFA2 intron splicing. Individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) combined with RNA-Seq revealed that RS2Z35 and RS2Z36, which make up a plant-specific clade of SR proteins, not only regulate HSFA2 but approximately 50% of RNAs that undergo HS-sensitive alternative splicing, with preferential binding to purine-rich RNA motifs. Single and double CRISPR rs2z mutant lines show a dysregulation of splicing and exhibit lower basal and acquired thermotolerance compared to wild type plants. Our results suggest that RS2Z35 and RS2Z36 have a central role in mitigation of the negative effects of HS on RNA splicing homeostasis, and their emergence might have contributed to the increased capacity of plants to acclimate to high temperatures.

Abstract High temperatures cause heat stress (HS), which has negative effects on plant growth and development and affects many cellular processes including pre-mRNA splicing. In tomato plants the splicing profile of many of genes is altered under HS, including that of HSFA2 , a central transcriptional regulator of thermotolerance. To identify the core splicing regulators of HS-sensitive alternative splicing, we used HSFA2 as bait and identified two plant-specific members of the serine/arginine-rich family of splicing factors, namely RS2Z35 and RS2Z36, that inhibit HSFA2 intron splicing. Single and double CRISPR mutants of these proteins show dysregulated splicing of many genes and exhibit lower basal and acquired thermotolerance. Individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) of tomato leaves revealed that the majority of HS-sensitive alternatively spliced RNAs are bound by RS2Z35 and RS2Z36 and this interaction occurs at purine-rich RNA motifs. Phenotypic and transcriptome analyses revealed that RS2Z35 and RS2Z36 are important players in the stress response and thermotolerance in plants that mitigate the negative effects of HS on RNA splicing homeostasis.

The entire RNA lifecycle, spanning from transcription to decay, is intricately regulated by RNA-binding proteins (RBPs). To understand their precise functions, it is crucial to identify direct targets, pinpoint their exact binding sites, and unravel the underlying specificity in vivo. Individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation 2 (iCLIP2) is a state-of-the-art technique that enables the identification of RBP binding sites at single-nucleotide resolution. However, in the field of microbiology, optimized iCLIP protocols compared to mammalian systems are lacking. Here, we present the first microbial iCLIP2 approach using the multi-RRM domain protein Rrm4 from the fungus Ustilago maydis as an example. Key challenges such as inherently high RNase and protease activity in fungi were addressed by improving mechanical cell disruption and lysis buffer composition. Our modifications increased the yield of crosslink events and improved the identification of Rrm4 binding sites. Thus, we were able to pinpoint that Rrm4 binds the stop codons of nuclear-encoded mRNAs of mitochondrial respiratory complex I, III and V - revealing an intimate link between endosomal mRNA transport and mitochondrial physiology. Thus, our study serves as a paradigm for optimizing iCLIP2 procedures in challenging organisms or tissues under high RNase/ protease conditions.