Abstract Purpose Development of ipsilateral breast carcinoma following a diagnosis of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) has been assumed to represent recurrence of the primary tumour. However, this may not be the case and it is important to know how often recurrences are new primary tumours to ensure appropriate individualised therapy. Experimental Design Ipsilateral primary-recurrence pairs (n=78) were sequenced to test their clonal relatedness. Shared genetic events were identified from whole exome sequencing (n=54 pairs) using haplotype-specific copy number and phylogenetic analysis. The remaining pairs were sequenced by a targeted panel or low-coverage whole genome sequencing. We included 32 non-recurrent DCIS to compare the genetic profiles between recurrent and non-recurrent disease to develop a predictive biomarker. Results We found that 14% of DCIS recurrences were non-clonal, indicative of a new breast carcinoma. Four chromosomal changes (5q, 11q, 17q and 20q) and TP53 mutation were enriched in clonal primaries compared with non-recurrent DCIS (p<0.05, Fisher’s exact test). The prognostic value of TP53 was validated in an independent cohort using immunohistochemistry (HR=3.1; 95% CI 1.3-7.8). Non-clonal DCIS primaries had a very similar genetic profile to non-recurrent DCIS, suggesting this subset of cases would be identified as being at “low risk” of recurrence using tumour-intrinsic markers. Conclusions We have identified a substantial rate of new ipsilateral primary carcinomas after a diagnosis of DCIS. Our results suggest, as with invasive breast cancer, that if a recurrent tumour with an independent origin occurs, then the patient is at a high risk through the environment, the breast microenvironment and/or has a genetic predisposition. Importantly, the frequency of new primaries will influence the interpretation of findings in DCIS biomarker discovery studies as the true recurrence rate will be incorrect, affecting these efforts. Translational relevance Our finding that >10% of recurrent tumours are new primaries provides genetic evidence that the presence of DCIS confers a risk of a de novo breast cancer as well as recurrence. Identifying a biomarker of such risks might allow preventive actions, such as genetic testing, chemoprevention with tamoxifen or aromatase inhibitors, or bilateral mastectomy. The corollary of these findings is that de novo primaries in DCIS biomarker studies may have undermined efforts to find a biomarker of recurrence by reducing statistical power, since a tumour cell-intrinsic marker is unlikely to be predictive for a new primary. Even if a tumour molecular biomarker could stratify between non-recurrent and recurrent patients, it will under-detect patients at risk of new primaries. This issue raises concerns about utilising only a tumour cell-intrinsic biomarker in the clinical setting.

Abstract This abstract is being presented as a short talk in the scientific program. A full abstract is printed in the Proffered Abstracts section (PR007) of the Conference Program/Proceedings. Citation Format: Julia V Milne, Ebtihal Mustafa, Kenji Fujihara, Eric Kusnadi, Anna Trigos, Niko Thio, Maree Pechlivanis, Carlos Cabalag, Twishi Gulati, Kaylene Simpson, Cuong Duong, Luc Furic, Wayne Phillips, Nicholas Clemons. Delineating functional drivers of esophageal adenocarcinoma to identify synthetic lethal interactions [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: Expanding and Translating Cancer Synthetic Vulnerabilities; 2024 Jun 10-13; Montreal, Quebec, Canada. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(6 Suppl):Abstract nr A006.

Abstract Application of molecular targeted therapies for esophageal adenocarcinoma (EAC) has been limited by a lack of druggable oncogenic drivers. We propose that synthetic lethal interactions may provide new opportunities for targeted therapies in EAC. We have taken an integrated multi-omics approach incorporating Perturb-Seq (CRISPR editing combined with single cell RNA sequencing) and in vivo tumorigenesis assays to perform high-throughput characterisation of &gt;70 high-confidence EAC driver genes, and genome-wide CRISPR-Cas9 knockout screens in isogenic models of EAC tumorigenesis to identify disease relevant synthetic lethal genetic interactions. MS-based proteomics, reverse phase protein arrays, polysome profiling and bulk RNA-sequencing of isogenic models were utilised to interrogate the biology of bona fide EAC drivers and associated driver specific gene dependencies. The overall goals were to (i) enhance our understanding of EAC tumorigenesis, (ii) identify potential opportunities for therapeutic interventions targeting EAC drivers via synthetic lethal-like approaches, and (iii) reduce the complexity of genetic heterogeneity by categorising EAC drivers with similar phenotypic outcomes. Through our approach we have identified complex crosstalk between the tumor suppressor SMAD4 and regulation of mTOR signaling, with specific downstream effects on translational reprogramming in EAC. Mutation or loss of SMAD4 occurs in up to 20% of EAC, but not pre-malignant tissue (Barrett’s esophagus), and is sufficient to promote transformation of pre-malignant cells in our in vivo tumorigenesis model. In this model, xenotransplanted SMAD4-deficient (via CRISPR-Cas9 knockout or shRNA knockdown) Barrett’s metaplasia cells formed invasive, metastatic tumors after a period of latency. SMAD4 deficient cells had downregulated expression of 4E-BP1, which inhibits EIF4E, the cap-dependent translation initiation factor. This was accompanied by increased mTOR activity, including phosphorylation and inactivation of 4EBP1. Moreover, we found that SMAD4-deficient cells preferentially upregulate cap-dependent translation at the expense of IRES mediated translation. Furthermore, perturbation of additional negative regulators of mTOR signaling in combination with SMAD4 knockout exacerbated these effects and accelerated tumorigenesis in vivo. We have extended these findings to a model of Barrett’s esophagus patient-derived organoids (PDOs) and observed increased proliferative potential of our genetically modified PDOs. Finally, analysing gene ontologies for differentially expressed genes from Perturb-seq revealed that driver-dependent transcriptional changes can be categorized into a smaller number of functional pathways allowing us to potentially consider groups of drivers as functional units. This work advances our understanding of EAC tumorigenesis, provides new mechanistic insights into SMAD4-driven transformation as well as novel potential therapeutic avenues for SMAD4-deficient EAC. Citation Format: Julia V. Milne, Ebtihal Mustafa, Kenji Fujihara, Eric Kusnadi, Anna Trigos, Niko Thio, Maree Pechlivanis, Carlos Cabalag, Twishi Gulati, Kaylene Simpson, Cuong Duong, Luc Furic, Wayne Phillips, Nicholas Clemons. Delineating functional drivers of esophageal adenocarcinoma to identify synthetic lethal interactions [abstract]. In: Proceedings of the AACR Special Conference in Cancer Research: Expanding and Translating Cancer Synthetic Vulnerabilities; 2024 Jun 10-13; Montreal, Quebec, Canada. Philadelphia (PA): AACR; Mol Cancer Ther 2024;23(6 Suppl):Abstract nr PR007.