Summary The Agrobacterium vacuum infiltration method has made it possible to transform Arabidopsis thaliana without plant tissue culture or regeneration. In the present study, this method was evaluated and a substantially modified transformation method was developed. The labor‐intensive vacuum infiltration process was eliminated in favor of simple dipping of developing floral tissues into a solution containing Agrobacterium tumefaciens , 5% sucrose and 500 microliters per litre of surfactant Silwet L‐77. Sucrose and surfactant were critical to the success of the floral dip method. Plants inoculated when numerous immature floral buds and few siliques were present produced transformed progeny at the highest rate. Plant tissue culture media, the hormone benzylamino purine and pH adjustment were unnecessary, and Agrobacterium could be applied to plants at a range of cell densities. Repeated application of Agrobacterium improved transformation rates and overall yield of transformants approximately twofold. Covering plants for 1 day to retain humidity after inoculation also raised transformation rates twofold. Multiple ecotypes were transformable by this method. The modified method should facilitate high‐throughput transformation of Arabidopsis for efforts such as T‐DNA gene tagging, positional cloning, or attempts at targeted gene replacement.

Plant disease resistance genes function in highly specific pathogen recognition pathways. RPS2 is a resistance gene of Arabidopsis thaliana that confers resistance against Pseudomonas syringae bacteria that express avirulence gene avrRpt2 . RPS2 was isolated by the use of a positional cloning strategy. The derived amino acid sequence of RPS2 contains leucine-rich repeat, membrane-spanning, leucine zipper, and P loop domains. The function of the RPS2 gene product in defense signal transduction is postulated to involve nucleotide triphosphate binding and protein-protein interactions and may also involve the reception of an elicitor produced by the avirulent pathogen.

To develop a model system for molecular genetic analysis of plant-pathogen interactions, we studied the interaction between Arabidopsis thaliana and the bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv tomato (Pst). Pst strains were found to be virulent or avirulent on specific Arabidopsis ecotypes, and single ecotypes were resistant to some Pst strains and susceptible to others. In many plant-pathogen interactions, disease resistance is controlled by the simultaneous presence of single plant resistance genes and single pathogen avirulence genes. Therefore, we tested whether avirulence genes in Pst controlled induction of resistance in Arabidopsis. Cosmids that determine avirulence were isolated from Pst genomic libraries, and the Pst avirulence locus avrRpt2 was defined. This allowed us to construct pathogens that differed only by the presence or absence of a single putative avirulence gene. We found that Arabidopsis ecotype Col-0 was susceptible to Pst strain DC3000 but resistant to the same strain carrying avrRpt2, suggesting that a single locus in Col-0 determines resistance. As a first step toward genetically mapping the postulated resistance locus, an ecotype susceptible to infection by DC3000 carrying avrRpt2 was identified. The avrRpt2 locus from Pst was also moved into virulent strains of the soybean pathogen P. syringae pv glycinea to test whether this locus could determine avirulence on soybean. The resulting strains induced a resistant response in a cultivar-specific manner, suggesting that similar resistance mechanisms may function in Arabidopsis and soybean.

The coevolution of interacting plants and microbes has given rise to a diverse array of exchanged signals and responses. Microbes that elicit a host response can be met variously with hospitable acceptance (as is the case with symbionts such as nitrogen-fixing Rhizobium bacteria), with tardy recognition and moderately effective defenses (as for most interactions that result in disease), or with a strong and rapid defense response that blocks further infection (Dixon and Lamb, 1990; Keen, 1990; Long and Staskawicz, 1993). This latter form of disease resistance forms the subject of this review and is known variously as race-specific resistance, gene-for-gene resistance, or hypersensitive resistance. Activation of gene-for-gene resistance typically depends on specific recognition of the invading pathogen by the plant (Keen, 1990). Numerous individual plant genes have been identified that control gene-for-gene resistance, and these genes are known as resistance (R) genes. Study of gene-for-gene resistance might be justified solely by the intrigue of plant-pathogen coevolution or as a model for signal transduction research in which an organism perceives and responds to its environment. However, the topic takes on greater interest dueto its pivotal impact on crop health and food production. Plant diseases cause billions of dollars in lost harvest annually, and in some instances, these losses have severe consequences for humans (Agrios, 1988; Schumann, 1991). One of the most convenient, inexpensive, and environmentally sound ways to control plant disease is to utilize disease-resistam varieties, and plant breeders make extensive use of classically defined R genes (Agrios, 1988). Recent work has revealed the structure of a number of plant R genes, and a striking degree of similarity among these genes has been observed. After briefly introducing the subject of R genes and avirulence (Avo genes, this review provides an overview of the conserved structural components that are predicted in the proteins encoded by R genes. The cloning of R genes has stimulated additional research that is also discussed, including structure-function analysis of R gene-encoded proteins, isolation of additional R genes, identification of functionally related components of the defense signal transduction cascade, and engineering of improved disease resistance in plants. RESISTANCE GENES, AVIRULENCE GENES, AND PLANT DEFENSE

Gene-for-gene disease resistance typically includes a programmed cell death response known as the hypersensitive response (HR). The Arabidopsis thaliana dnd1 mutant was previously isolated as a line that failed to produce the HR in response to avirulent Pseudomonas syringae pathogens; plants homozygous for the recessive dnd1 - 1 mutation still carry out effective gene-for-gene resistance. The dnd1 - 1 mutation also causes constitutive systemic resistance and elevated levels of salicylic acid. In the present study, a positional cloning approach was used to isolate DND1. DND1 encodes the same protein as AtCNGC2, a cyclic nucleotide-gated ion channel of previously unknown organismal function that can allow passage of Ca 2+ , K + and other cations [Leng, Q., Mercier, R. W., Yao, W. & Berkowitz, G. A. (1999) Plant Physiol. 121, 753–761]. By using a nahG transgene, we found that salicylic acid is required for the elevated resistance caused by the dnd1 mutation but that removal of salicylic acid did not completely eliminate the dwarf and loss-of-HR phenotypes of mutant dnd1 plants. A stop codon that would severely truncate the DND1 gene product was identified in the dnd1 - 1 allele. This demonstrates that broad-spectrum disease resistance and inhibition of the HR can be activated in plants by disruption of a cyclic nucleotide-gated ion channel.

Resistance to a damaging disease of soybean is conferred by a cluster of linked genes present in multiple copies.

The cell death response known as the hypersensitive response (HR) is a central feature of gene-for-gene plant disease resistance. A mutant line of Arabidopsis thaliana was identified in which effective gene-for-gene resistance occurs despite the virtual absence of HR cell death. Plants mutated at the DND1 locus are defective in HR cell death but retain characteristic responses to avirulent Pseudomonas syringae such as induction of pathogenesis-related gene expression and strong restriction of pathogen growth. Mutant dnd1 plants also exhibit enhanced resistance against a broad spectrum of virulent fungal, bacterial, and viral pathogens. The resistance against virulent pathogens in dnd1 plants is quantitatively less strong and is differentiable from the gene-for-gene resistance mediated by resistance genes RPS2 and RPM1. Levels of salicylic acid compounds and mRNAs for pathogenesis-related genes are elevated constitutively in dnd1 plants. This constitutive induction of systemic acquired resistance may substitute for HR cell death in potentiating the stronger gene-for-gene defense response. Although cell death may contribute to defense signal transduction in wild-type plants, the dnd1 mutant demonstrates that strong restriction of pathogen growth can occur in the absence of extensive HR cell death in the gene-for-gene resistance response of Arabidopsis against P. syringae.

The Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) gene MEKK1 encodes a mitogen-activated protein kinase kinase kinase that has been implicated in the activation of the map kinases MPK3 and MPK6 in response to the flagellin elicitor peptide flg22. In this study, analysis of plants carrying T-DNA knockout alleles indicated that MEKK1 is required for flg22-induced activation of MPK4 but not MPK3 or MPK6. Experiments performed using a kinase-impaired version of MEKK1 (K361M) showed that the kinase activity of MEKK1 may not be required for flg22-induced MPK4 activation or for other macroscopic FLS2-mediated responses. MEKK1 may play a structural role in signaling, independent of its protein kinase activity. mekk1 knockout mutants display a severe dwarf phenotype, constitutive callose deposition, and constitutive expression of pathogen response genes. This dwarf phenotype was largely rescued by introduction into mekk1 knockout plants of either the MEKK1 (K361M) construct or a nahG transgene that degrades salicylic acid. When treated with pathogenic bacteria, the K361M plants were slightly more susceptible to an avirulent strain of Pseudomonas syringae and showed a delayed hypersensitive response, suggesting a role for MEKK1 kinase activity in this aspect of plant disease resistance. Our results indicate that MEKK1 acts upstream of MPK4 as a negative regulator of pathogen response pathways, a function that may not require MEKK1's full kinase activity.

Synthetic peptides that specifically bind nuclear hormone receptors offer an alternative approach to small molecules for the modulation of receptor signaling and subsequent gene expression. Here we describe the design of a series of novel stapled peptides that bind the coactivator peptide site of estrogen receptors. Using a number of biophysical techniques, including crystal structure analysis of receptor-stapled peptide complexes, we describe in detail the molecular interactions and demonstrate that all-hydrocarbon staples modulate molecular recognition events. The findings have implications for the design of stapled peptides in general.

ABSTRACT Rhg1 mediates soybean resistance to soybean cyst nematode. Glyma.18G022400 , one of three resistance-conferring genes at the complex Rhg1 locus, encodes the putative amino acid transporter AAT Rhg1 whose mode of action is largely unknown. We discovered that AAT Rhg1 protein abundance increases 7- to 15-fold throughout root cells penetrated by SCN. These root cells develop increased abundance of vesicles and larger vesicle-like bodies. AAT Rhg1 was often associated with these vesicles. AAT Rhg1 abundance remained low in syncytia (plant reprogrammed feeding cells), unlike the Rhg1 α-SNAP protein whose abundance was previously shown to increase in syncytia. In N. benthamiana , if soybean AAT Rhg1 was present, oxidative stress promoted formation of larger macrovesicles and they contained AAT Rhg1 . AAT Rhg1 was found to interact with GmRBOHC2, a soybean ortholog of Arabidopsis RBOHD previously found to exhibit upregulated expression upon SCN infection. Reactive oxygen species (ROS) generation was more elevated when AAT Rhg1 and GmRBOHC2 abundance were co-expressed. These findings suggest that AAT Rhg1 contributes to SCN resistance along the penetration path as SCN invades the plant, and does so at least in part by interactions with GmRBOHC2 that increase ROS production. The study also shows that Rhg1 resistance functions via at least two spatially and temporally separate modes of action.