Light-driven proton-pumping rhodopsins are widely distributed in many microorganisms. They convert sunlight energy into proton gradients that serve as energy source of the cell. Here we report a new functional class of a microbial rhodopsin, a light-driven sodium ion pump. We discover that the marine flavobacterium Krokinobacter eikastus possesses two rhodopsins, the first, KR1, being a prototypical proton pump, while the second, KR2, pumps sodium ions outward. Rhodopsin KR2 can also pump lithium ions, but converts to a proton pump when presented with potassium chloride or salts of larger cations. These data indicate that KR2 is a compatible sodium ion–proton pump, and spectroscopic analysis showed it binds sodium ions in its extracellular domain. These findings suggest that light-driven sodium pumps may be as important in situ as their proton-pumping counterparts. Light-driven proton-pumping rhodopsins are widely distributed in microorganisms and convert sunlight energy into proton gradients. Inoue et al. report the discovery of a light-driven sodium ion pump from marine bacteria.

Summary ChRmine 1 , a recently-discovered bacteriorhodopsin-like cation-conducting channelrhodopsin 1, 2 , exhibits puzzling properties (unusually-large photocurrents, exceptional red-shift in action spectrum, and extreme light-sensitivity) that have opened up new opportunities in optogenetics 1, 3–5 . ChRmine and its homologs function as light-gated ion channels, but by primary sequence more closely resemble ion pump rhodopsins; the molecular mechanisms for passive channel conduction in this family of proteins, as well as the unusual properties of ChRmine itself, have remained mysterious. Here we present the cryo-electron microscopy structure of ChRmine at 2.0 Å resolution. The structure reveals striking architectural features never seen before in channelrhodopsins including trimeric assembly, a short transmembrane-helix 3 unwound in the middle of the membrane, a prominently-twisting extracellular-loop 1, remarkably-large intracellular cavities and extracellular vestibule, and an unprecedented hydrophilic pore that extends through the center of the trimer, separate from the three individual monomer pores. Electrophysiological, spectroscopic, and computational analyses provide insight into conduction and gating of light-gated channels with these distinct design features, and point the way toward structure-guided creation of novel channelrhodopsins for optogenetic applications in biology.

SUMMARY The KCR channelrhodopsins are recently-discovered light-gated ion channels with high K + selectivity, a property that has attracted broad attention among biologists– due to intense interest in creating novel inhibitory tools for optogenetics leveraging this K + selectivity, and due to the mystery of how this selectivity is achieved in the first place. Indeed, the molecular and structural mechanism for K + selectivity in KCRs has remained especially puzzling since these 7-transmembrane retinal-binding proteins completely lack structural similarity with known K + channels, which generally coordinate K + in a precisely symmetric conduction pathway formed by a tight interface among multiple small monomeric channel subunits (presumably not an accessible mechanism for the large KCR rhodopsin proteins). Here we present the cryo-electron microscopy structures of two KCRs from Hyphochytrium catenoides with distinct spectral properties for light absorption and channel actuation, Hc KCR1, and Hc KCR2, at resolutions of 2.6 and 2.5 Å, respectively. Structural comparison revealed first an unusually-shaped retinal binding pocket which induces rotation of the retinal in Hc KCR2, explaining the large spectral difference between Hc KCR1 and 2. Next, our combined structural, electrophysiological, computational, and spectroscopic analyses revealed a new solution to the challenging problem of K + -selective transport. KCRs indeed do not exhibit the canonical tetrameric K + selectivity filter that specifically coordinates dehydrated K + ; instead, single KCR monomers form a size exclusion filter using aromatic residues at the extracellular side of the pore which inhibits passage of bulky hydrated ions. This unique feature allows KCRs to function as K + channels under relevant physiological conditions, providing not only a novel mechanism for achieving high K + permeability ratios in biological ion channels, but also a framework for designing the next generation of inhibitory optogenetic tools. In Brief The first structures of K + -selective channelrhodopsins ( Hc KCR1 and 2) are determined, revealing a K + selectivity mechanism distinctly different from canonical K + channels. Highlights The cryo-EM structures of K + -selective channelrhodopsins, Hc KCR1 and 2, in nanodisc Conditions under which naturally-occurring microbial rhodopsins have a 6-s- cis retinal Identification of key residues for high K + permeability ratios The unique K + selectivity mechanism of KCRs

Abstract Rhodopsins convert light into signals and energy in animals and microbes. Heliorhodopsins (HeRs), a recently discovered new rhodopsin family, are widely present in archaea, bacteria, unicellular eukaryotes, and giant viruses, but their function remains unknown. Here we report that a viral HeR from Emiliania huxleyi virus 202 (V2HeR3) is a light-gated proton channel. V2HeR3 absorbs blue-green lights, and the active intermediate contains the deprotonated retinal Schiff base. Site-directed mutagenesis study revealed that E191 in TM6 constitutes the gate together with the retinal Schiff base. E205 and E215 form a proton accepting group of the Schiff base, whose mutations converted the protein into an outward proton pump. Three environmental viral HeRs from the same group, as well as a more distantly related HeR exhibited similar proton-transport activity, indicating that HeR functions might be diverse similarly to type-1 microbial rhodopsins. Some strains of E. huxleyi contain one HeR that is related to the viral HeRs, while its viruses Eh V-201 and Eh V-202 contain two and three HeRs, respectively. Except for V2HeR3 from Eh V-202, none of these proteins exhibit ion-transport activity. Thus, when expressed in the E. huxleyi cell membranes, only V2HeR3 has the potential to depolarize the host cells by light, possibly to overcome the host defense mechanisms or to prevent superinfection. The neuronal activity generated by V2HeR3 suggests that it can potentially be used as an optogenetic tools, like type-1 microbial rhodopsins.

Abstract Microbial rhodopsins are photoreceptive membrane proteins utilized as molecular tools in optogenetics. In this paper, a machine learning (ML)-based model was constructed to approximate the relationship between amino acid sequences and absorption wavelengths using ~800 rhodopsins with known absorption wavelengths. This ML-based model was specifically designed for screening rhodopsins that are red-shifted from representative rhodopsins in the same subfamily. Among 5,558 candidate rhodopsins suggested by a protein BLAST search of several protein databases, 40 were selected by the ML-based model. The wavelengths of these 40 selected candidates were experimentally investigated, and 32 (80%) showed red-shift gains. In addition, four showed red-shift gains > 20 nm, and two were found to have desirable ion-transporting properties, indicating that they were potentially useful in optogenetics. These findings suggest that an ML-based model can reduce the cost for exploring new functional proteins.

Most autophagy-related genes, or ATG genes, have been identified through studies using budding yeast. Although the functions of the ATG genes are well understood, the contributions of individual genes to non-selective and various types of selective autophagy remain to be fully elucidated. In this study, we quantified the activity of non-selective autophagy, the cytoplasm-to-vacuole targeting (Cvt) pathway, mitophagy, endoplasmic reticulum (ER)-phagy and pexophagy in all Saccharomyces cerevisiae atg mutants. Among the mutants of the core autophagy genes considered essential for autophagy, the atg13 mutant and mutants of the genes involved in the two ubiquitin-like conjugation systems retained residual autophagic functionality. In particular, mutants of the Atg8 ubiquitin-like conjugation system (the Atg8 system) exhibited substantial levels of non-selective autophagy, the Cvt pathway and pexophagy, although mitophagy and ER-phagy were undetectable. Atg8-system mutants also displayed intravacuolar vesicles resembling autophagic bodies, albeit at significantly reduced size and frequency. Thus, our data suggest that membranous sequestration and vacuolar delivery of autophagic cargo can occur in the absence of the Atg8 system. Alongside these findings, the comprehensive analysis conducted here provides valuable datasets for future autophagy research.

Abstract Schizorhodopsins (SzRs), a new rhodopsin family identified in Asgard archaea, are phylogenetically located at an intermediate position between type-1 microbial rhodopsins and heliorhodopsins. SzRs reportedly work as light-driven inward H + pumps, as xenorhodopsin. Here we report the crystal structure of SzR AM_5_00977 at 2.1 Å resolution. The SzR structure superimposes well on that of bacteriorhodopsin rather than heliorhodopsin, suggesting that SzRs are classified with type-1 rhodopsins. The structure-based mutagenesis study demonstrated that the residues N100 and V103 are essential for color tuning in SzRs. The cytoplasmic parts of transmembrane helices 2, 6, and 7 in SzR are shorter than those in the other microbial rhodopsins. Thus, E81 is located near the cytosol, playing a critical role in the inward H + release. We suggested the H + is not metastably trapped in E81 and released through the water-mediated transport network from the retinal Schiff base to the cytosol. Moreover, most residues on the H + transport pathway are not conserved between SzRs and xenorhodopsins, suggesting that they have entirely different inward H + release mechanisms.

Abstract Rhodopsins are widespread in microbes residing in diverse aquatic environments across the globe. Recently, a new unusual rhodopsin family, the heliorhodopsins (HeRs), was discovered, distributed among diverse bacteria, archaea, eukarya and even viruses. Here, using functional metagenomics on samples from Lake Ha’Hula and Ein Afek reserve, we found and characterized ten HeRs representing divergent members of the family. The expressed HeRs absorb light in the green and yellow wavelengths and originate from Actinobacteria, Chloroflexi and Archaea. The photocycle of the HeR from Chloroflexi revealed a low accumulation of the M-intermediate that we connect to the lack of two conserved histidine residues in transmembrane helices 1 and 2 in this protein. Another of HeR, from Actinobacteria, exhibited an unusually fast photocycle (166 ms, 5 times faster than HeR-48C12). To further explore the still unresolved question of the HeR function, we performed an analysis of protein families among genes neighboring HeRs, in our clones and thousands of other microbes. This analysis revealed a putative connection between HeRs and genes involved in oxidative stress. At the same time, very few protein families were found to distinguish genes surrounding prokaryotic HeRs from those surrounding rhodopsin pumps. The strongest association was found with the DegV family involved in activation of fatty acids and uncharacterized family DUF2177, which allowed us to hypothesize that HeRs are involved in membrane lipid remodeling. This work further establishes functional metagenomics as a simple and fruitful method of screening for new rhodopsins. Significance The recently discovered divergent rhodopsin family of heliorhodopsins is abundant in freshwater environments. In this study, we sampled a habitat rich in dissolved organic matter to increase our chances of finding spectrally shifted rhodopsins. Using functional metagenomics, diverse heliorhodopsins absorbing green and yellow light were discovered. The metagenomic clones originated from diverse prokaryotic groups: Actinobacteria, Chloroflexi and even Archaea, emphasizing the versatility of the E. coli expression system used. Photocycles of representative heliorhodopsins were measured and exhibited diverse kinetic characteristics. Analysis of genes neighboring heliorhodopsins in diverse prokaryotes revealed their putative connection to membrane lipid re-modeling and oxidative stress. Our findings suggest that functional metagenomics is a productive method for the discovery of new and diverse rhodopsins.