Abstract Fluorination of proteins by cotranslational incorporation of non-canonical amino acids is a valuable tool for enhancing biophysical stability. Despite many prior studies investigating the effects of fluorination on equilibrium stability, its influence on non-equilibrium mechanical stability remains unknown. Here, we used single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope (AFM) to investigate the influence of fluorination on unfolding and unbinding pathways of a mechanically ultrastable bacterial adhesion complex. We assembled modular polyproteins comprising the tandem dyad XModule-Dockerin (XMod-Doc) bound to a globular Cohesin (Coh) domain. By applying tension across the binding interface, and quantifying single-molecule unfolding and rupture events, we mapped the energy landscapes governing the unfolding and unbinding reactions. We then used sense codon suppression to substitute trifluoroleucine (TFL) in place of canonical leucine (LEU) globally in XMod-Doc, or selectively within the Doc subdomain of a mutant XMod-Doc. Although TFL substitution thermally destabilized XMod-Doc, it had little effect on XMod-Doc:Coh binding affinity at equilibrium. When we mechanically dissociated global TFL-substituted XMod-Doc from Coh, we observed the emergence of a new unbinding pathway with a lower energy barrier. Counterintuitively, when fluorination was restricted to Doc, we observed mechano-stabilization of the non-fluorinated neighboring XMod domain. These results suggest that intramolecular deformation networks can be modulated by fluorination, and further highlight significant differences between equilibrium thermostability, where all constructs were destabilized, and non-equilibrium mechanostability, where XMod was strengthened. Future work is poised to investigate the influence of non-natural amino acids on mechanically-accelerated protein unfolding and unbinding reaction pathways.

Abstract We used single-molecule AFM force spectroscopy (AFM-SMFS) to screen residues along the backbone of a non-antibody protein binding scaffold (lipocalin/anticalin), and determine the optimal anchor point that maximizes binding strength of the interaction with its target (CTLA-4). By incorporating non-canonical amino acids into anticalin, and using click chemistry to attach an Fgβ peptide at internal sequence positions, we were able to mechanically dissociate anticalin from CTLA-4 by pulling from eight different anchoring residues using an AFM cantilever tip. We found that pulling on the anticalin from residue 60 or 87 resulted in significantly higher rupture forces and a decrease in k off by 2-3 orders of magnitude over a force range of 50-200 pN. Five of the six internal pulling points tested were significantly more stable than N- or C-terminal anchor points, rupturing at up to 250 pN at loading rates of 0.1-10 nN sec -1 . Anisotropic network modelling and molecular dynamics simulations using the Gō-MARTINI approach explained the mechanism underlying the geometric dependency of mechanostability. These results suggest that optimization of attachment residue position for therapeutic and diagnostic cargo can provide large improvements in binding strength, allowing affinity maturation without requiring genetic mutation of binding interface residues.

Abstract Single-molecule force spectroscopy (SMFS) is a powerful method for studying folding states and mechanical properties of proteins, however, it requires surface immobilization of proteins onto force-transducing probes such as cantilevers or microscale beads. A common immobilization method relies on coupling surface-exposed lysine residues to carboxylated surfaces using 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS). Because proteins typically contain many lysine groups, this strategy results in a heterogeneous distribution of tether positions in the molecule. Genetically encoded peptide tags (e.g., ybbR) provide alternative chemistries for achieving site-specific immobilization, but thus far a direct comparison of site-specific vs. lysine-based immobilization strategies to assess effects on the observed mechanical properties was lacking. Here, we directly compared lysine- vs. ybbR-based protein immobilization in SMFS assays using several model polyprotein systems. Our results show that lysine-based immobilization results in significant signal deterioration for monomeric streptavidin-biotin interactions, and loss of the ability to correctly classify unfolding pathways in a multipathway Cohesin-Dockerin system. We developed a mixed immobilization approach where a site-specifically tethered ligand was used to probe surface-bound proteins immobilized through lysine groups, and found partial recovery of specific signals. The mixed immobilization approach represents a viable alternative for mechanical assays on in vivo -derived samples or other proteins of interest where genetically encoded tags are not feasible.

Achieving high binding strength and efficient delivery of molecular cargo to tumor cells is a significant challenge in cancer immunotherapy. Current research has focused on obtaining antibodies that bind their targets with high affinity (i.e. low equilibrium dissociation constant, K D ). However, such an approach neglects the influence of hydrodynamic fluid flow along the surfaces of cells and tissues, which can impart mechanical stress and lead to rapid unbinding of antibodies under flow. Here, we investigated how altering the anchor point within a non-antibody binding scaffold called Anticalin can enhance particle adhesion to the immune checkpoint CTLA-4 on human cells experiencing hydrodynamic shear. By introducing bioorthogonal clickable amino acids into Anticalin at various positions, we investigated the influence of different unbinding geometries on the stability of the Anticalin:(CTLA-4) complex. Both single-molecule AFM and quantitative bead-based adhesion assays on CTLA-4 + human cells demonstrate how optimal choice of the anchor point can stabilize the complex and enhance the adhesion strength of receptor-targeted particles. These results demonstrate how anchor point engineering can enhance particle adhesion and delivery to immunotherapy targets.

Catch bonds are a rare class of protein-protein interactions where the bond lifetime increases under an external pulling force. Here, we report how modification of anchor geometry generates catch bonding behavior for the mechanostable Dockerin G:Cohesin E (DocG:CohE) adhesion complex found on human gut bacteria. Using AFM single-molecule force spectroscopy in combination with bioorthogonal click chemistry, we mechanically dissociated the complex using five precisely controlled anchor geometries. When tension was applied through residue #13 on CohE and the N-terminus of DocG, the complex behaved as a two-state catch bond, while in all other tested pulling geometries, including the native configuration, it behaved as a slip bond. We used a kinetic Monte Carlo model with experimentally derived parameters to simulate rupture force and lifetime distributions, achieving strong agreement with experiments. Single-molecule FRET measurements further demonstrated that the complex does not exhibit dual binding mode behavior at equilibrium but unbinds along multiple pathways under force. Together, these results show how mechanical anisotropy and anchor point selection can be used to engineer artificial catch bonds.

Abstract We report the application of machine learning techniques to accelerate classification and analysis of protein unfolding trajectories from force spectroscopy data. Using kernel methods, logistic regression and triplet loss, we developed a workflow called Forced Unfolding and Supervised Iterative Online (FUSION) where a user classifies a small number of repeatable unfolding patterns encoded as image data, and a machine is tasked with identifying similar images to classify the remaining data. We tested the workflow using two case studies on a multi-domain XMod-Dockerin/Cohesin complex, validating the approach first using synthetic data generated with a Monte Carlo algorithm, and then deploying the method on experimental atomic force spectroscopy data. FUSION efficiently separated traces that passed quality filters from unusable ones, classified curves with high accuracy, and identified unfolding pathways undetected by the user. This study demonstrates the potential of machine learning to accelerate data analysis, and generate new insights in protein biophysics.

Bacterial colonization of the human intestine requires firm adhesion of bacteria to insoluble targets under hydrodynamic flow. Here we report the molecular mechanism behind an mechanostable protein complex responsible for resisting high shear forces and adhering bacteria to cellulose fibers in the human gut. Using single-molecule force spectroscopy (SMFS), single-molecule FRET (smFRET), and molecular dynamics (MD) simulations, we resolved two binding modes and three unbinding reaction pathways of a mechanically ultrastable R. champanellensis (Rc) Dockerin-Cohesin (Doc-Coh) complex. The complex assembles in two discrete binding modes with significantly different mechanical properties, with one breaking at ~500 pN and the other at ~200 pN at loading rates from 1-100 nN/sec. A neighboring X-module domain allosterically regulates the binding interaction and inhibits one of the low-force pathways at high loading rates, giving rise to a new mechanism of catch bonding that manifests under force ramp protocols. Multi-state Monte Carlo simulations show strong agreement with experimental results, validating the proposed kinetic scheme. These results explain mechanistically how gut microbes regulate cell adhesion strength at high shear stress through intricate molecular mechanisms including dual-binding modes, mechanical allostery and catch bonds.

Protein-protein complexes can vary in mechanical stability depending on the direction from which force is applied. Here we investigated the anisotropic mechanical stability of a molecular complex between a therapeutic non-immunoglobulin scaffold called Affibody and the extracellular domain of the immune checkpoint protein PD-L1. We used a combination of single-molecule AFM force spectroscopy (AFM-SMFS) with bioorthogonal clickable peptide handles, shear stress bead adhesion assays, molecular modeling, and steered molecular dynamics (SMD) simulations to understand the pulling point dependency of mechanostability of the Affibody:(PD-L1) complex. We observed diverse mechanical responses depending on the anchor point. For example, pulling from residue #22 on Affibody generated an intermediate unfolding event attributed to partial unfolding of PD-L1, while pulling from Affibody's N-terminus generated force-activated catch bond behavior. We found that pulling from residue #22 or #47 on Affibody generated the highest rupture forces, with the complex breaking at up to ~ 190 pN under loading rates of ~10