A number of studies have shown that both innate and adaptive immune defense mechanisms greatly influence the course of human dengue virus (DENV) infections, but little is known about the innate immune response of the mosquito vector Aedes aegypti to arbovirus infection. We present evidence here that a major component of the mosquito innate immune response, RNA interference (RNAi), is an important modulator of mosquito infections. The RNAi response is triggered by double-stranded RNA (dsRNA), which occurs in the cytoplasm as a result of positive-sense RNA virus infection, leading to production of small interfering RNAs (siRNAs). These siRNAs are instrumental in degradation of viral mRNA with sequence homology to the dsRNA trigger and thereby inhibition of virus replication. We show that although dengue virus type 2 (DENV2) infection of Ae. aegypti cultured cells and oral infection of adult mosquitoes generated dsRNA and production of DENV2-specific siRNAs, virus replication and release of infectious virus persisted, suggesting viral circumvention of RNAi. We also show that DENV2 does not completely evade RNAi, since impairing the pathway by silencing expression of dcr2, r2d2, or ago2, genes encoding important sensor and effector proteins in the RNAi pathway, increased virus replication in the vector and decreased the extrinsic incubation period required for virus transmission. Our findings indicate a major role for RNAi as a determinant of DENV transmission by Ae. aegypti.

Mosquitoes ( Aedes aegypti ) were genetically modified to exhibit impaired vector competence for dengue type 2 viruses (DENV-2). We exploited the natural antiviral RNA interference (RNAi) pathway in the mosquito midgut by constructing an effector gene that expresses an inverted-repeat (IR) RNA derived from the premembrane protein coding region of the DENV-2 RNA genome. The A. aegypti carboxypeptidase A promoter was used to express the IR RNA in midgut epithelial cells after ingestion of a bloodmeal. The promoter and effector gene were inserted into the genome of a white-eye Puerto Rico Rexville D (Higgs’ white eye) strain by using the nonautonomous mariner MosI transformation system. A transgenic family, Carb77, expressed IR RNA in the midgut after a bloodmeal. Carb77 mosquitoes ingesting an artificial bloodmeal containing DENV-2 exhibited marked reduction of viral envelope antigen in midguts and salivary glands after infection. DENV-2 titration of individual mosquitoes showed that most Carb77 mosquitoes poorly supported virus replication. Transmission in vitro of virus from the Carb77 line was significantly diminished when compared to control mosquitoes. The presence of DENV-2-derived siRNAs in RNA extracts from midguts of Carb77 and the loss of the resistance phenotype when the RNAi pathway was interrupted proved that DENV-2 resistance was caused by a RNAi response. Engineering of transgenic A. aegypti that show a high level of resistance against DENV-2 provides a powerful tool for developing population replacement strategies to control transmission of dengue viruses.

ABSTRACT The yellow fever mosquito Aedes aegypti is a major vector of arthropod-borne viruses, including dengue, chikungunya, and Zika. A novel approach to mitigate arboviral infections is to generate mosquitoes refractory to infection by overexpressing antiviral effector molecules. Such an approach requires a mechanism to spread these antiviral effectors through a population, for example, by using CRISPR/Cas9-based gene drive (GD) systems. Critical to the design of a single-locus autonomous GD is that the selected genomic locus be amenable to both GD and appropriate expression of the antiviral effector. In our study, we used reverse engineering to target two intergenic genomic loci, which had previously shown to be highly permissive for antiviral effector gene expression, and we further investigated the use of three promoters ( nanos, β2-tubulin, or zpg ) for Cas9 expression. We then quantified the accrual of insertions or deletions (indels) after single generation crossings, measured maternal effects, and assessed fitness costs associated with the various transgenic lines to model the rate of GD fixation. Overall, MGDrivE modeling suggested that when an autonomous GD is placed into an intergenic locus, the GD system will eventually be blocked by the accrual of GD blocking resistance alleles and ultimately be lost in the population. Moreover, while genomic locus and promoter selection were critically important for the initial establishment of the autonomous GD, it was the fitness of the GD line that most strongly influenced the persistence of the GD in the simulated population. As such, we propose that when autonomous CRISPR/Cas9 based GD systems are anchored in an intergenic locus, they temporarily result in a strong population replacement effect, but as GD-blocking indels accrue, the GD becomes exhausted due to the fixation of CRISPR resistance alleles. Significance statement For the purpose of population replacement, CRISPR/Cas9 based gene drives (GD) have been developed in Anopheles spp. and split GDs have been developed in Ae. aegypti. In our study, we developed autonomous GD in Ae. aegypti and positioned the drives in intergenic loci ideal for the expression of antiviral effector genes. Our results suggest that when the GD is placed into an intergenic locus, there is rapid introgression of the GD resulting in a transient population replacement followed by loss of the drive as resistance alleles accrue. Fitness of the transgenic lines and maternal deposition of CRISPR/Cas9 components were the major contributing factors affecting the perseverance of the GD in our population models.

Abstract Mosquitoes are the most notorious hematophagous insects and due to their blood feeding behavior and genetic compatibility, numerous mosquito species are highly efficient vectors for certain human pathogenic parasites and viruses. The mosquito midgut is the principal organ of blood meal digestion and nutrient absorption. It is also the initial site of infection with blood meal acquired parasites and viruses. We conducted an analysis based on single-nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) to assess the cellular diversity of the midgut and how individual cells respond to blood meal ingestion to facilitate its digestion. Our study revealed the presence of 20 distinguishable cell-type clusters in the female midgut of Aedes aegypti . The identified cell types included intestinal stem cell (ISC), enteroblasts (EB), differentiating EB (dEB), enteroendocrine cells (EE), enterocytes (EC), EC-like cells, cardia cells, and visceral muscle (VM) cells. Blood meal ingestion dramatically changed the overall midgut cell type composition, profoundly increasing the proportions of ISC and three EC/EC like clusters. In addition, transcriptional profiles of all cell types were strongly affected while genes involved in various metabolic processes were significantly upregulated. Our study provides a basis for further physiological and molecular studies on blood digestion, nutrient absorption, and cellular homeostasis in the mosquito midgut.

Aedes aegypti is the predominant vector for arboviruses including dengue, Zika, and chikungunya viruses, which infect over 100 million people annually. Mosquito population replacement strategies in which pathogen-susceptible mosquitoes in the field are replaced by laboratory-engineered pathogen-resistant strains are novel genetic control measures to inhibit the spread of malaria or arboviral diseases in endemic regions. To suppress arbovirus transmission following this approach, a mosquito strain needs to be transgenically modified to express an antiviral effector molecule which is linked to a gene drive (GD) system to both inhibit viral replication in the mosquito and drive the engineered resistance trait throughout a wild-type population. As a proof-of-concept, we tested the performance of two single locus CRISPR-Cas9 based GD for Ae. aegypti population replacement in small cage populations over 12 generations. Starting from a low release threshold of 1:9 GD bearing males, we observed two GD constructs in which Cas9 was expressed from different promoters increase in frequency in all discrete, non-overlapping cage populations. By generation 12, 56-79% of mosquitoes in six cage populations had at least one GD copy. The allele frequencies of the GD increased from <5% at release to >50% by G7 post-release for the nanos-driven Cas9 GD and by G10 in populations harboring the zpg-driven Cas9 GD. Insertion and deletion mutation (indel) frequency was measured for each discrete generation in pooled samples from the six populations harboring GD. We found that populations with Cas9 expression under control of the nanos-promoter accumulated gene drive blocking indels (GDBI) at more than twice the rate of populations harboring the zpg-promoter driven GD. Both GD produced de novo mutations at similar rates, with a difference in selection being the primary cause of greater indel accrual in the nanos-driven GD populations. Our results demonstrate that two single-locus, CRISPR-Cas9-based homing GD located at an intergenic locus exhibit continuous super-Mendelian inheritance in populations of Ae. aegypti. We further analyze the effects of fitness cost on the stability of low-threshold CRISPR/Cas9 based GD in populations of Ae. aegypti. This study demonstrates the feasibility of low-threshold, single-locus Cas9 gene drives for Ae. aegypti population replacement.

Chikungunya virus (CHIKV), which induces chikungunya fever and chronic arthralgia, is an emerging public health concern. Safe and efficient vaccination strategies are needed to prevent or mitigate virus-associated acute and chronic morbidities for preparation of future outbreaks. Eilat (EILV)/CHIKV, a chimeric alphavirus which contains the structural proteins of CHIKV and the non-structural proteins of EILV, does not replicate in vertebrate cells. The chimeric virus was previously reported to induce protective adaptive immunity in mice. Here, we assessed the capacity of the virus to induce quick and durable protection in cynomolgus macaques. EILV/CHIKV protected macaques from wild-type (WT) CHIKV infection one year after a single dose vaccination. Transcriptome and

The establishment of a productive dengue virus (DENV) infection in the midgut epithelial cells of Aedes aegypti is critical for the viral transmission cycle. The hypothesis that DENV virions interact directly with specific mosquito midgut proteins was explored. We found that DENV serotype 2 (DENV2) pretreated with trypsin interacted with a single 31 kDa protein, identified as AAEL011180 by protein mass spectrometry. This putative receptor is a highly conserved protein and has orthologs in culicine and anopheline mosquitoes. We confirmed that impairing the expression of AAEL011180 in the midgut of Ae. aegypti females abolished the interaction with DENV2, and the virus also bound to immobilized recombinant purified receptor. Furthermore, recombinant DENV2 surface E glycoprotein bound to recombinant AAEL011180 with high affinity (38.2 nM) in binding kinetic analysis using surface plasmon resonance. The gene for this DENV2 E protein receptor (EPrRec) was disrupted, but since the gene is essential in Ae. aegypti, only heterozygote knockout (ΔEPrRec +/− ) females could be recovered. Further reducing EPrRec mRNA expression in the midgut of ΔEPrRec +/− females by systemic dsRNA injection significantly reduced the prevalence of DENV2 midgut infection. EPrRec also interacts with heat shock protein 70 cognate 3 (Hsc70-3), and silencing Hsc70-3 expression in ΔEPrRec females also reduced the prevalence of DENV2 midgut infection.