Identifying transcript location in cells Identifying where specific RNAs occur within a cell or tissue has been limited by technology and imaging capabilities. Expansion microscopy has allowed for better visualization of small structures by expanding the tissues with a polymer- and hydrogel-based system. Alon et al. combined expansion microscopy with long-read in situ RNA sequencing, resulting in a more precise visualization of the location of specific transcripts. This method, termed “ExSeq” for expansion sequencing, was used to detect RNAs, both new transcripts and those previously demonstrated to localize to neuronal dendrites. Unlike other in situ sequencing methods, ExSeq does not target sets of genes. This technology thus unites spatial resolution, multiplexing, and an unbiased approach to reveal insights into RNA localization and its physiological roles in developing and active tissue. Science , this issue p. eaax2656

Accurate measurement of clonal genotypes, mutational processes, and replication states from individual tumor-cell genomes will facilitate improved understanding of tumor evolution. We have developed DLP+, a scalable single-cell whole-genome sequencing platform implemented using commodity instruments, image-based object recognition, and open source computational methods. Using DLP+, we have generated a resource of 51,926 single-cell genomes and matched cell images from diverse cell types including cell lines, xenografts, and diagnostic samples with limited material. From this resource we have defined variation in mitotic mis-segregation rates across tissue types and genotypes. Analysis of matched genomic and image measurements revealed correlations between cellular morphology and genome ploidy states. Aggregation of cells sharing copy number profiles allowed for calculation of single-nucleotide resolution clonal genotypes and inference of clonal phylogenies and avoided the limitations of bulk deconvolution. Finally, joint analysis over the above features defined clone-specific chromosomal aneuploidy in polyclonal populations.

ABSTRACT A set of increasingly powerful approaches are enabling spatially resolved measurements of growing numbers of molecular features in biological samples. While important insights can be derived from the two-dimensional data that many of these technologies generate, it is clear that extending these approaches into the third and fourth dimensions will magnify their impact. Realizing biological insights from datasets where thousands to millions of cells are annotated with tens to hundreds of parameters in space will require the development of new computational and visualization strategies. Here, we describe Theia, a virtual reality-based platform, which enables exploration and analysis of either volumetric or segmented, molecularly-annotated, three-dimensional datasets, with the option to extend the analysis to time-series data. We also describe our pipeline for generating annotated 3D models of breast cancer and supply several datasets to enable users to explore the utility of Theia for understanding cancer biology in three dimensions.

Abstract Expanding the arsenal of prophylactic approaches against SARS-CoV-2 is of utmost importance, specifically those strategies that are resistant to antigenic drift in Spike. Here, we conducted a screen with over 16,000 RNAi triggers against the SARS-CoV-2 genome using a massively parallel assay to identify hyper-potent siRNAs. We selected 10 candidates for in vitro validation and found five siRNAs that exhibited hyper-potent activity with IC50<20pM and strong neutralisation in live virus experiments. We further enhanced the activity by combinatorial pairing of the siRNA candidates to develop siRNA cocktails and found that these cocktails are active against multiple types of variants of concern (VOC). We examined over 2,000 possible mutations to the siRNA target sites using saturation mutagenesis and identified broad protection against future variants. Finally, we demonstrated that intranasal administration of the siRNA cocktail effectively attenuates clinical signs and viral measures of disease in the Syrian hamster model. Our results pave the way to development of an additional layer of antiviral prophylaxis that is orthogonal to vaccines and monoclonal antibodies.

Abstract With the aim of producing a 3D representation of tumours, IMAXT uses a large variety of modalities in order to acquire tumour samples and produce a map of every cell in the tumour and its host environment. With the large volume and variety of data produced in the project we develop automatic data workflows and analysis pipelines and introduce a research methodology where scientists connect to a cloud environment to perform analysis close to where data are located instead of bringing data to their local computers. Here we present the data and analysis infrastructure, discuss the unique computational challenges and describe the analysis chains developed and deployed to generate molecularly annotated tumour models. Registration is achieved by use of a novel technique involving spherical fiducial marks that are visible in all imaging modalities used within IMAXT.

Imaging mass cytometry (IMC) is a powerful multiplexed tissue imaging technology that allows simultaneous detection of more than 30 makers on a single slide. It has been increasingly used for singlecell-based spatial phenotyping in a wide range of samples. However, it only acquires a small, rectangle field of view (FOV) with a low image resolution that hinders downstream analysis. Here, we reported a highly practical dual-modality imaging method that combines high-resolution immunofluorescence (IF) and high-dimensional IMC on the same tissue slide. Our computational pipeline uses the whole slide image (WSI) of IF as a spatial reference and integrates small FOVs IMC into a WSI of IMC. The high-resolution IF images enable accurate single-cell segmentation to extract robust high-dimensional IMC features for downstream analysis. We applied this method in esophageal adenocarcinoma of different stages, identified the single-cell pathology landscape via reconstruction of WSI IMC images, and demonstrated the advantage of the dual-modality imaging strategy.Highly multiplexed tissue imaging allows visualization of the spatially resolved expression of multiple proteins at the single-cell level. Although imaging mass cytometry (IMC) using metal isotope-conjugated antibodies has a significant advantage of low background signal and absence of autofluorescence or batch effect, it has a low resolution that hampers accurate cell segmentation and results in inaccurate feature extraction. In addition, IMC only acquires mm 2 -sized rectangle regions, which limits its application and efficiency when studying larger clinical samples with non-rectangle shapes. To maximize the research output of IMC, we developed the dual-modality imaging method based on a highly practical and technical improvement requiring no extra specialized equipment or agents and proposed a comprehensive computational pipeline that combines IF and IMC. The proposed method greatly improves the accuracy of cell segmentation and downstream analysis and is able to obtain whole slide image IMC to capture the comprehensive cellular landscape of large tissue sections.

Abstract Mapping the molecular identities and functions of cells within their spatial context is key to understanding the complex interplay within and between tissue neighbourhoods. A wide range of methods have recently enabled spatial profiling of cellular anatomical contexts, some offering single-cell resolution. These use different barcoding schemes to encode either the location or the identity of target molecules. However, all these technologies face a trade-off between spatial resolution, depth of profiling, and scalability. Here, we present B arcoding by A ctivated L inkage of Indexes (BALI), a method that uses light to write combinatorial spatial molecular barcodes directly onto target molecules in situ, enabling multi-omic profiling by next generation sequencing. A unique feature of BALI is that the user can define the number, size, and shape, and resolution of the spatial locations to be interrogated, with the potential to profile millions of distinct regions with subcellular precision. As a proof of concept, we used BALI to capture the transcriptome, chromatin accessibility, or both simultaneously, from distinct areas of the mouse brain in single tissue sections, demonstrating strong concordance with publicly available datasets. BALI therefore combines high spatial resolution, high throughput, histological compatibility, and workflow accessibility to enable powerful spatial multi-omic profiling.

Abstract Tumor heterogeneity is thought to be a major barrier to successful cancer treatment due to the presence of drug resistant clonal lineages. However, identifying the characteristics of such lineages that underpin resistance to therapy has remained challenging. Here we utilize clonal transcriptomics with WILD-seq; W holistic I nterrogation of L ineage D ynamics by seq uencing, in mouse models of triple-negative breast cancer (TNBC) to understand response and resistance to therapy, including BET bromodomain inhibition and taxane-based chemotherapy. This analysis revealed oxidative stress protection by NRF2 as a major mechanism of taxane resistance and led to the discovery that our tumor models are collaterally sensitive to asparagine deprivation therapy using the clinical stage drug L-asparaginase after frontline treatment with docetaxel. In summary, clonal transcriptomics with WILD-seq identifies mechanisms of resistance to chemotherapy that are also operative in patients and pin points asparagine bioavailability as a druggable vulnerability of taxane resistant lineages.

The function of a neural circuit is determined by the details of its synaptic connections. At present, the only available method for determining a neural wiring diagram with single synapse precision--a "connectome"--is based on imaging methods that are slow, labor-intensive and expensive. Here we present SYNseq, a method for converting the connectome into a form that can exploit the speed and low cost of modern high-throughput DNA sequencing. In SYNseq, each neuron is labeled with a unique random nucleotide sequence--an RNA "barcode"--which is targeted to the synapse using engineered proteins. Barcodes in pre- and postsynaptic neurons are then associated through protein-protein crosslinking across the synapse, extracted from the tissue, and then joined into a form suitable for sequencing. Although at present the inefficiency in our hands of barcode joining precludes the widespread application of this approach, we expect that with further development SYNseq will enable tracing of complex circuits at high speed and low cost.