TRPV4 channels are critical regulators of blood vascular function and have been shown to be dysregulated in many disease conditions in association with inflammation and tissue fibrosis. These are key features in the pathophysiology of lymphatic system diseases, including lymphedema and lipedema; however, the role of TRPV4 channels in the lymphatic system remains largely unexplored. TRPV4 channels are calcium permeable, non-selective cation channels that are activated by diverse stimuli, including shear stress, stretch, temperature, and cell metabolites, which may regulate lymphatic contractile function.

Collecting lymphatic vessels (cLVs) exhibit spontaneous contractions with a pressure-dependent frequency, but the identity of the lymphatic pacemaker cell is still debated. By analogy to pacemakers in the GI and lower urinary tracts, proposed cLV pacemaker cells include interstitial cells of Cajal like cells (ICLC), pericytes, as well as the lymphatic muscle (LMCs) cells themselves. Here we tested the extent to which these cell types are invested into the mouse cLV wall and if any cell type exhibited morphological and functional processes characteristic of pacemaker cells: a contiguous network; spontaneous Ca 2+ transients; and depolarization-induced propagated contractions. We employed inducible Cre (iCre) mouse models routinely used to target these specific cell populations including: c-kitCreER T2 to target ICLC; PdgfrβCreER T2 to target pericytes; PdgfrαCreER TM to target CD34 + adventitial fibroblast-like cells or ICLC; and Myh11CreER T2 to target LMCs. These specific inducible Cre lines were crossed to the fluorescent reporter ROSA26mT/mG, the genetically encoded Ca 2+ sensor GCaMP6f, and the light-activated cation channel rhodopsin2 (ChR2). c-KitCreER T2 labeled both a sparse population of LECs and round adventitial cells that responded to the mast cell activator compound 48-80. PdgfrβCreER T2 drove recombination in both adventitial cells and LMCs, limiting its power to discriminate a pericyte specific population. PdgfrαCreER TM labeled a large population of interconnected, oak leaf-shaped cells primarily along the adventitial surface of the vessel. Titrated induction of the smooth muscle-specific Myh11CreER T2 revealed a LMC population with heterogeneous morphology. Only LMCs consistently, but heterogeneously, displayed spontaneous Ca 2+ events during the diastolic period of the contraction cycle, and whose frequency was modulated in a pressure-dependent manner. Optogenetic depolarization through the expression of ChR2 by Myh11CreER T2 , but not PdgfrαCreER TM or c-KitCreER T2 , resulted in a propagated contraction. These findings support the conclusion that LMCs, or a subset of LMCs, are responsible for mouse cLV pacemaking.The presence and functionality of proposed pacemaker cells in collecting lymphatic vessels was tested with various mouse Cre models to drive expression of a recombination reporter ROSA26mT/mG, a genetically encoded Ca 2+ sensor GCaMP6f, or the optogenetic tool channel-rhodopsin2. Lymphatic CD34 + adventitial cells co-express PDGFRΑ + while cKit + cells are mast cells; and neither cell type demonstrated pacemaking functionality. Myh11CreER T2 identified lymphatic muscle cells which exhibited pacemaker behaviors such as pressure-dependent calcium events during diastole and propagated contraction induced by optical stimulation of channel-rhodopsin2.