Plant-associated microorganisms have been shown to critically affect host physiology and performance, suggesting that evolution and ecology of plants and animals can only be understood in a holobiont (host and its associated organisms) context. Host-associated microbial community structures are affected by abiotic and host factors, and increased attention is given to the role of the microbiome in interactions such as pathogen inhibition. However, little is known about how these factors act on the microbial community, and especially what role microbe–microbe interaction dynamics play. We have begun to address this knowledge gap for phyllosphere microbiomes of plants by simultaneously studying three major groups of Arabidopsis thaliana symbionts (bacteria, fungi and oomycetes) using a systems biology approach. We evaluated multiple potential factors of microbial community control: we sampled various wild A. thaliana populations at different times, performed field plantings with different host genotypes, and implemented successive host colonization experiments under lab conditions where abiotic factors, host genotype, and pathogen colonization was manipulated. Our results indicate that both abiotic factors and host genotype interact to affect plant colonization by all three groups of microbes. Considering microbe–microbe interactions, however, uncovered a network of interkingdom interactions with significant contributions to community structure. As in other scale-free networks, a small number of taxa, which we call microbial “hubs,” are strongly interconnected and have a severe effect on communities. By documenting these microbe–microbe interactions, we uncover an important mechanism explaining how abiotic factors and host genotypic signatures control microbial communities. In short, they act directly on “hub” microbes, which, via microbe–microbe interactions, transmit the effects to the microbial community. We analyzed two “hub” microbes (the obligate biotrophic oomycete pathogen Albugo and the basidiomycete yeast fungus Dioszegia) more closely. Albugo had strong effects on epiphytic and endophytic bacterial colonization. Specifically, alpha diversity decreased and beta diversity stabilized in the presence of Albugo infection, whereas they otherwise varied between plants. Dioszegia, on the other hand, provided evidence for direct hub interaction with phyllosphere bacteria. The identification of microbial “hubs” and their importance in phyllosphere microbiome structuring has crucial implications for plant–pathogen and microbe–microbe research and opens new entry points for ecosystem management and future targeted biocontrol. The revelation that effects can cascade through communities via “hub” microbes is important to understand community structure perturbations in parallel fields including human microbiomes and bioprocesses. In particular, parallels to human microbiome “keystone” pathogens and microbes open new avenues of interdisciplinary research that promise to better our understanding of functions of host-associated microbiomes.

Roots of healthy plants are inhabited by soil-derived bacteria, fungi, and oomycetes that have evolved independently in distinct kingdoms of life. How these microorganisms interact and to what extent those interactions affect plant health are poorly understood. We examined root-associated microbial communities from three Arabidopsis thaliana populations and detected mostly negative correlations between bacteria and filamentous microbial eukaryotes. We established microbial culture collections for reconstitution experiments using germ-free A. thaliana. In plants inoculated with mono- or multi-kingdom synthetic microbial consortia, we observed a profound impact of the bacterial root microbiota on fungal and oomycetal community structure and diversity. We demonstrate that the bacterial microbiota is essential for plant survival and protection against root-derived filamentous eukaryotes. Deconvolution of 2,862 binary bacterial-fungal interactions ex situ, combined with community perturbation experiments in planta, indicate that biocontrol activity of bacterial root commensals is a redundant trait that maintains microbial interkingdom balance for plant health.

Genetic differences between Arabidopsis thaliana accessions underlie the plant’s extensive phenotypic variation, and until now these have been interpreted largely in the context of the annotated reference accession Col-0. Here we report the sequencing, assembly and annotation of the genomes of 18 natural A. thaliana accessions, and their transcriptomes. When assessed on the basis of the reference annotation, one-third of protein-coding genes are predicted to be disrupted in at least one accession. However, re-annotation of each genome revealed that alternative gene models often restore coding potential. Gene expression in seedlings differed for nearly half of expressed genes and was frequently associated with cis variants within 5 kilobases, as were intron retention alternative splicing events. Sequence and expression variation is most pronounced in genes that respond to the biotic environment. Our data further promote evolutionary and functional studies in A. thaliana, especially the MAGIC genetic reference population descended from these accessions. The genomes and transcriptomes of 18 natural Arabidopsis thaliana strains have been compared with that of Col-0, the most widely used A. thaliana wild type that was sequenced as part of the Arabidopsis Genome Initiative. The comparison has been used to create a comprehensive overview of genetic variability in this classic 'laboratory' plant. Each individual genome was compared with every other individual genome in a 'many-to-many' approach, which maximizes the capture of gene variations.

From Blight to Powdery Mildew Pathogenic effects of microbes on plants have widespread consequences. Witness, for example, the cultural upheavals driven by potato blight in the 1800s. A variety of microbial pathogens continue to afflict crop plants today, driving both loss of yield and incurring the increased costs of control mechanisms. Now, four reports analyze microbial genomes in order to understand better how plant pathogens function (see the Perspective by Dodds ). Raffaele et al. (p. 1540 ) describe how the genome of the potato blight pathogen accommodates transfer to different hosts. Spanu et al. (p. 1543 ) analyze what it takes to be an obligate biotroph in barley powdery mildew, and Baxter et al. (p. 1549 ) ask a similar question for a natural pathogen of Arabidopsis . Schirawski et al. (p. 1546 ) compared genomes of maize pathogens to identify virulence determinants. Better knowledge of what in a genome makes a pathogen efficient and deadly is likely to be useful for improving agricultural crop management and breeding.

Biotic and abiotic interactions shape natural microbial communities. The mechanisms behind microbe-microbe interactions, particularly those protein-based, are not well understood. We hypothesize that secreted proteins are a powerful and highly specific toolset to shape and defend plant niches. We have studied Albugo candida , an obligate plant parasite from the protist Oomycota phylum, for its potential to modulate the growth of bacteria through secretion of proteins into the apoplast. Amplicon sequencing and network analysis of Albugo -infected and uninfected samples revealed an abundance of negative correlations between Albugo and other phyllosphere microbes. Analysis of the apoplastic proteome of Albugo colonized leaves combined with machine-learning predictors enabled the selection of candidates for heterologous expression and study of their inhibitory activity. We found that three of the candidate proteins show selective antimicrobial activity on gram-positive bacteria isolated from Arabidopsis thaliana and that these inhibited bacteria are important for the stability of the community structure. We could ascribe the antibacterial activity of the candidates to intrinsically disordered regions and positively correlate it with net charge. This is the first report of protist proteins with antimicrobial activity under apoplastic conditions that therefore are potential biocontrol tools for targeted manipulations of the microbiome.

Abstract Cyanobacterial biofilms are ubiquitous and play important roles in diverse environments, yet, understanding of the processes underlying development of these aggregates is just emerging. Here we report cell specialization in formation of Synechococcus elongatus PCC 7942 biofilms - a hitherto unknown characteristic of cyanobacterial multicellularity. We show that only a quarter of the cell population expresses at high levels the four-gene ebfG -operon that is required for biofilm formation. Almost all cells, however, are assembled in the biofilm. Detailed characterization of EbfG4 encoded by this operon revealed cell-surface localization as well as its presence in the biofilm matrix. Moreover, EbfG1-3 were shown to form amyloid structures such as fibrils and are thus likely to contribute to the matrix structure. These data suggest a beneficial ‘division of labour’ during biofilm formation where only some of the cells allocate resources to produce matrix proteins – ‘public goods’ that support robust biofilm development by the majority of the cells. Additionally, previous studies revealed the operation of a self-suppression mechanism that depends on an extracellular inhibitor, which supresses transcription of the ebfG -operon. Here we revealed inhibitor activity at an early growth stage and its gradual accumulation along the exponential growth phase in correlation with cell density. Data, however, do not support a threshold-like phenomenon known for quorum-sensing in heterotrophs. Together, data presented here demonstrate cell specialization and imply density-dependent regulation thereby providing novel insights into cyanobacterial communal behaviour. Graphical Abstract

Abstract Plants are not only challenged by pathogenic organisms, but also colonized by commensal microbes. The network of interactions these microbes establish with their host and amongst each other is suggested to contribute to the immune responses of plants against pathogens. In wild Arabidopsis thaliana populations, the oomycete pathogen Albugo laibachii has been shown to play an influential role in structuring the leaf phyllosphere. We show that the epiphytic yeast Moesziomyces bullatus ex Albugo on Arabidopsis, a close relative of pathogenic smut fungi, is an antagonistic member of the A. thaliana phyllosphere, which reduces infection of A. thaliana by A. laibachii . Combination of transcriptome analysis, reverse genetics and protein characterization identified a GH25 hydrolase with lysozyme activity as the major effector of this microbial antagonism. Our findings broaden the understanding of microbial interactions within the phyllosphere, provide insights into the evolution of epiphytic basidiomycete yeasts and pave the way for the development of novel biocontrol strategies.

Summary Crop disease outbreaks are often associated with clonal expansions of single pathogenic lineages. To determine whether similar boom-and-bust scenarios hold for wild plant pathogens, we carried out a multi-year multi-site survey of Pseudomonas in the natural host Arabidopsis thaliana. The most common Pseudomonas lineage corresponded to a pathogenic clade present in all sites. Sequencing of 1,524 Pseudomonas genomes revealed this lineage to have diversified approximately 300,000 years ago, containing dozens of genetically distinct pathogenic sublineages. These sublineages have expanded in parallel within the same populations and are differentiated both at the level of gene content and disease phenotype. Such coexistence of diverse sublineages indicates that in contrast to crop systems, no single strain has been able to overtake these A. thaliana populations in the recent past. Our results suggest that the selective pressures acting on a plant pathogen in wild hosts may be more complex than those in agricultural systems.

Abstract Microbiome profiling is revolutionizing our understanding of biological mechanisms such as metaorganismal (host+microbiome) assembly, functions and adaptation. Amplicon sequencing of multiple conserved, phylogenetically informative loci is an instrumental tool for characterization of the highly diverse microbiomes of natural systems. Investigations in many study systems are hindered by loss of essential sequencing depth due to amplification of non-target DNA from hosts or overabundant microorganisms. This issue requires urgent attention to address ecologically relevant problems using high throughput, high resolution microbial profiling. Here, we introduce a simple, low cost and highly flexible method using standard oligonucleotides (“blocking oligos”) to block amplification of non-targets and an R package to aid in their design. They can be dropped into practically any two-step amplicon sequencing library preparation pipeline. We apply them in leaves, a system presenting exceptional challenges with host and non-target microbial amplification. Blocking oligos designed for use in eight target loci reduce undesirable amplification of host and non-target microbial DNA by up to 90%. In addition, 16S and 18S “universal” plant blocking oligos efficiently block most plant hosts, leading to increased microbial alpha diversity discovery without biasing beta diversity measurements. By blocking only chloroplast 16S amplification, we show that blocking oligos do not compromise quantitative microbial load information inherent to plant-associated amplicon sequencing data. Using these tools, we generated a near-complete survey of the Arabidopsis thaliana leaf microbiome based on diversity data from eight loci and discuss complementarity of commonly used amplicon sequencing regions for describing leaf microbiota. The blocking oligo approach has potential to make new questions in a variety of study systems more tractable by making amplicon sequencing more targeted, leading to deeper, systems-based insights into microbial discovery.

ABSTRACT Nitrogen fixation is carried out inside nodules of legumes by symbiotic rhizobia. Rhizobia dominate the nodule microbiome, however other non-rhizobial bacteria also colonise root nodules. It is not clear whether these less abundant nodule colonisers impact nodule function. In order to investigate the relationship between the nodule microbiome and nodule function as influenced by the soil microbiome, we used a metabarcoding approach to characterise the communities inside Lotus burttii, Lotus japonicus and Lotus corniculatus nodules from plants that were either starved or healthy resulting from inoculations with different soil suspensions in a closed pot experiment. We found that the nodule microbiome of all tested Lotus species differed according to inoculum, but only that of L. burttii varied with plant health. Using a machine learning algorithm, we also found that among the many non-rhizobial bacteria inside the nodule, amplicon sequence variants that were related to Pseudomonas were the most indicative signatures of a healthy plant nodule microbiome. These results support the hypothesis that legume nodule endophytes may play a role in the overall success of root-nodule symbiosis, albeit in a plant host specific manner.