Abstract Gene perturbation approaches have evolved as powerful tools for understanding the function of genes and curing inherited diseases. Here, we develop a method that combines the merits of RNAi and CRISPR technology by rational design of Cas9 ribonucleoprotein (RNP) with a “gRNA-shRNA” component. The RNP, termed Cas9-RNAi, has a gRNA containing a 3’ extension that can be processed to a functional siRNA via dorsha/dicer enzyme mediated cleavage within cells. We prepared the Cas9-RNAi RNPs by streamline co-expression of Cas9 enzymes and the “gRNA-shRNA” ribonucleotides in Escherichia coli strain HT115(DE)3. Transferring the Cas9-RNAi RNPs into mammalian cells achieves multidimensional genome manipulation, e.g., simultaneously knock out and knock down the target genes. Moreover, by introduction of a shRNA against the gene of human DNA ligase 4 ( LIG4 ), significantly improved homology-directed repair was attained. Together, we develop a simple-to-use CRISPR RNP tool that has great potentials in precise genome editing, gene function analysis and gene therapy.

New CRISPR-based genome editing technologies are developed to continuedly drive advances in life sciences, which, however, are predominantly derived from systems of Type II CRISPR-Cas9 and Type V CRISPR-Cas12a for eukaryotes. Here we report a novel CRISPR-n(nickase)Cas3 genome editing tool established upon an endogenous Type I system of Zymomonas mobilis . We demonstrate that nCas3 variants can be created by alanine-substituting any catalytic residue of the Cas3 helicase domain. While nCas3 overproduction via plasmid shows severe cytotoxicity; an in situ nCas3 introduces targeted double-strand breaks, facilitating genome editing, without visible cell killing. By harnessing this CRISPR-nCas3, deletion of genes or genomic DNA stretches can be consistently accomplished with near-100% efficiencies, including simultaneous removal of two large genomic fragments. Our work describes the first establishment of a CRISPR-nCas3-based genome editing technology, thereby offering a simple, easy, yet useful approach to convert many endogenous Type I systems into advanced genome editing tools. We envision that many CRISPR-nCas3-based toolkits would be soon available for various industrially important non-model bacteria that carry active Type I systems to facilitate high-throughput prokaryotic engineering.

CRISPR/Cas ribonucleoprotein (RNP) complexes have been recently used as promising biological tools with plenty of applications, however, there are by far no efficient methods to prepare them at large scale and low cost. Here, we present a simple method to directly produce and purify Cas RNP, including the widely used Cas9 and Cas12a nuclease, from E.coli in a single step using an ultra-high-affinity CL7/Im7 purification system. The prepared Cas RNP shows high stability, solid nuclease activity in vitro, and profound genome editing efficiency in vivo. Our method is convenient, cost-effective, and applicable to prepare other CRISPR associated nucleases.

Abstract Huanglongbing (HLB) is caused by “ Candidatus Liberibacter asiaticus” and is spread by citrus psyllids. It is a highly damaging and infectious disease of citrus for which there is no reliable treatment. Timely detection and removal of diseased trees is an effective strategy to control HLB. Various citrus cultivars infected with HLB exhibit distinct symptoms, posing a challenge to generalize HLB detection methods across multiple cultivars. Volatile organic compounds (VOCs) in HLB‐infected leaves from cultivars grown in different regions were comprehensively analysed by gas chromatography–mass spectrometry (GC‐MS) and gas chromatography‐ion mobility spectrometry (GC‐IMS), aiming to establish a new generalized HLB detection method applicable to a range of citrus cultivars. The changes in VOCs were analysed in leaves of four citrus cultivars after infection with HLB. The results showed that there was a similar response to HLB infection in different citrus cultivars, and this response was reflected in both the concentration and type of VOCs. By combining GC‐MS and GC‐IMS with orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS‐DA) model, the accurate identification of the HLB infection status of different citrus cultivars was achieved, with the prediction indices reaching 0.994 for GC‐MS and 0.972 for GC‐IMS. In addition, 27 compounds were identified that were significantly different between citrus cultivars affected by HLB and healthy plants. This study provides valuable insights into the changes in VOCs in citrus cultivars after HLB infection and lays the theoretical foundation for VOC‐based HLB detection strategies.

ABSTRACT Argonaute (Ago) proteins are programmable nuclease found in both eukaryotes and prokaryotes. Prokaryotic Argonaute proteins (pAgos) share a high degree of structural homology with eukaryotic Argonaute proteins (eAgos) and eAgos are considered to evolve from pAgos. However, the majority of studied pAgos prefer to cleave DNA targets, and eAgos exclusively cleave RNA targets. Here, we characterize a novel pAgo, Mbp Ago, from psychrotolerant bacteria Mucilaginibacter paludis that can be programmed with DNA guides and prefers to cleave RNA targets rather than DNA targets. Mbp Ago can be active at a wide range of temperatures (4-65°C). In comparison with previously studied pAgos, Mbp Ago is able to utilize 16-nt long 5’phosphorylated and 5’hydroxylated DNA guides for efficient and precise cleavage and displays no obvious preference for the 5’end nucleotide of a guide. Furthermore, the cleavage efficiency can be regulated by mismatches in the central and 3’supplementary regions of the guide. Mbp Ago can efficiently cleave highly-structured RNA targets using both 5’phosphorylated and 5’hydroxylated DNA guides in the presence of Mg 2+ or Mn 2+ . In conclusion, we have demonstrated that Mbp Ago is a unique programmable nuclease that has a strong preference for RNA targets, with great potential applications in the field of nucleic acid biotechnology.

ABSTRACT Argonaute proteins are widespread in prokaryotes and eukaryotes. Most prokaryotic Argonaute proteins (pAgos) use 5’P-gDNA to target complementary DNA. However, more and more studies on the properties of pAgos make their functions more diversified. Previously reported pAgos only possess several forms of high activity in all eight cleavage patterns, which limits their practical applications. Here, we described a unique pAgo from Marinitoga hydrogenitolerans (MhAgo) with eight cleavage activities. MhAgo can utilize all four types of guides (5’OH-gDNA, 5’P-gDNA, 5’OH-gRNA, and 5’P-gRNA) for ssDNA and RNA cleavage. Further studies demonstrated that MhAgo had high activities with 16-21 nt guides and no obvious preferences for the 5’-end nucleotides of 5’OH-guides. Unexpectedly, MhAgo had different preferences for the 5’-end nucleotides of 5’P-guides depending on the types of targets. Although the specificity of MhAgo was related to the types of guides, single mismatches in the central and 3’-supplementary regions of guides greatly reduced the cleavage efficiency. Additionally, the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) demonstrated MhAgo had the weakest affinity for 5’P-gRNA:tRNA duplex, which was consistent with its cleavage efficiency. In conclusion, MhAgo is highly active under a wide range of conditions and can be used for programmable endonucleolytic cleavage of both ssDNA and RNA substrates. The abundant biochemical characteristics of MhAgo broaden our understanding of pAgos and expand the potential application in nucleic acids manipulations.

In this paper, we focus on the online 3D bin packing problem, a classical strong NP-hard problem. In the problem, each item is unknown before bin packing is performed, and the arrival of the item requires immediate bin packing, which has many applications in industrial automation. In this paper, we propose a greedy algorithm for multi-indicator fusion to solve this problem by defining a series of evaluation indicators during bin packing, determining the weights of these indicators to be fused by SVR algorithm and Quasi-Newton Methods, and finally selecting the placement with the highest score of the fused indicators to be placed. The experimental results show that this method can solve the online 3D bin packing problem and is competitive with other algorithms in terms of space utilization and the number of bins, and the running time is fully completed to meet the online bin packing requirements.

Abstract Background Rhizomucor miehei (RM) lipase is a regioselective lipase widely used in food, pharmaceutical and biofuel industries. However, the high cost and low purity of the commercial RM lipase limit its industrial applications. Therefore, it is necessary to develop cost-effective strategies for large-scale preparation of this lipase. The present study explored the high-level expression of RM lipase using superfolder green fluorescent protein (sfGFP)-mediated Escherichia coli secretion system. Results The sfGFP (−15) mutant was fused to the C-terminus of RM lipase to mediate its secretion expression. The yield of the fusion protein reached approximately 5.1 g/L with high-density fermentation in 5-L fermentors. Unlike conventional secretion expression methods, only a small portion of the target protein was secreted into the cell culture while majority of the fusion protein was still remained in the cytoplasm. However, in contrast to intracellular expression, the target protein in the cytoplasm could be transported efficiently to the supernatant through a simple washing step with equal volume of phosphate saline (PBS), without causing cell disruption. Hence, the approach facilitated the downstream purification step of the recombinant RM lipase. Moreover, contamination or decline of the engineered strain and degradation or deactivation of the target enzyme can be detected efficiently because they exhibited bright green fluorescence. Next, the target protein was immobilized with anion-exchange and macropore resins. Diethylaminoethyl sepharose (DEAE), a weak-basic anion-exchange resin, exhibited the highest bind capacity but inhibited the activity of RM lipase dramatically. On the contrary, RM lipase fixed with macropore resin D101 demonstrated the highest specific activity. Although immobilization with D101 didn’t improve the activity of the enzyme, the thermostability of the immobilized enzyme elevated significantly. The immobilized RM lipase retained approximately 90% of its activity after 3-h incubation at 80 °C. Therefore, D101 was chosen as the supporting material of the target protein. Conclusion The present study established a highly efficient strategy for large-scale preparation of RM lipase. This innovative technique not only provides high-purity RM lipase at a low cost but also has great potential as a platform for the preparation of lipases in the future.

Abstract Scientists have conducted in-depth studies on single-stranded DNA (ssDNA) binding and protein interaction network of single-stranded DNA binding proteins (SSBs). SSBs are widely present in cells from lower prokaryotes to higher mammals and are important proteins for ssDNA protection. In-depth studies in recent years have revealed a wide range of interactions between SSBs and other proteins. Studies have shown that in addition to playing the role of ssDNA protector, SSBs are also important members of biochemical pathways such as DNA replication and recombination. In this study, a single-stranded DNA binding protein SSF encoded by E. coli F plasmid with highly conserved N-terminal region was demonstrated to have ssDNA binding ability similar to E. coli SSB through gel migration experiments. At the same time, the dsDNA binding ability of SSF was also demonstrated, and the dissociation constant of this interaction (in the range of microliters) was determined by Micro-scale Thermophoresis (MST). Through the above experiments, a previously unreported SSB with dsDNA binding ability was revealed, and the region interacting with dsDNA was determined to be the C-terminal unstructured region. This study lays a foundation for further understanding of the mechanism of bacterial conjugation conducted by F plasmid, as well as the potential dsDNA binding ability and biological significance of other SSBs.