Abstract The plant trans-Golgi network/early endosome (TGN/EE) is a major hub for secretory and endocytic trafficking with complex molecular mechanisms controlling sorting and transport of cargo. Vacuolar transport from the TGN/EE to multivesicular bodies/late endosomes (MVBs/LEs) is assumed to occur via clathrin-coated vesicles, although direct proof for their participation is missing. Here, we present evidence that post-TGN transport toward lytic vacuoles occurs independently of clathrin and that MVBs/LEs are derived from the TGN/EE through maturation. We show that the V-ATPase inhibitor concanamycin A significantly reduces the number of MVBs and causes TGN and MVB markers to colocalize in Arabidopsis thaliana roots. Ultrastructural analysis reveals the formation of MVBs from the TGN/EE and their fusion with the vacuole. The localization of the ESCRT components VPS28, VPS22, and VPS2 at the TGN/EE and MVBs/LEs indicates that the formation of intraluminal vesicles starts already at the TGN/EE. Accordingly, a dominant-negative mutant of VPS2 causes TGN and MVB markers to colocalize and blocks vacuolar transport. RNA interference–mediated knockdown of the annexin ANNAT3 also yields the same phenotype. Together, these data indicate that MVBs originate from the TGN/EE in a process that requires the action of ESCRT for the formation of intraluminal vesicles and annexins for the final step of releasing MVBs as a transport carrier to the vacuole.

Abstract H 2 O 2 has been recognized as an important signaling molecule in plants. We sought to establish a genetically encoded, fluorescent H 2 O 2 sensor that allows H 2 O 2 monitoring in all major subcompartments of a Chlamydomonas cell. To this end we engineered the hypersensitive H 2 O 2 sensor, roGFP2-Tsa2ΔC R , as a genetic part for the Chlamydomonas Modular Cloning toolbox. Using previously generated parts, together with new ones, we constructed modules and devices that target the sensor to the cytosol, nucleus, mitochondrial matrix, chloroplast stroma, thylakoid lumen, and ER. The sensor was functional in all compartments, except for the ER where it was fully oxidized. Employing our novel sensors, we show that H 2 O 2 produced by photosynthetic linear electron transport (PET) in the stroma leaks into the cytosol but only reaches other subcellular compartments if produced under non-physiological conditions. Our results thus imply the establishment of steep intracellular H 2 O 2 gradients under normal physiological conditions and suggest that the cytosolic complement of H 2 O 2 scavenging enzymes effectively limits H 2 O 2 diffusion. Furthermore, in heat stressed cells, we show that cytosolic H 2 O 2 levels closely mirror temperature up- and downshifts and are independent from PET. We anticipate that these sensors will greatly facilitate future investigations into H 2 O 2 biology in algal and plant cells.

Abstract Plant vacuoles play key roles in cellular homeostasis performing catabolic and storage functions, regulating pH and ion balance. The essential role of vacuoles for plant cell viability makes them a notoriously difficult subject to study impeding reaching the consensus on the mechanism of vacuolar establishment and the source of membrane material for it. Our previous suggestion of endoplasmic reticulum being the main membrane contributor for the tubular network of young vacuoles was recently challenged in a study proposing that young plant vacuoles comprise a set of individual vesicles that are formed de novo via homotypic fusion of multivesicular bodies (MVBs). To resolve these seemingly contradictory observations we have carefully revaluated both hypotheses. Here we provide a systematic overview of successive vacuolar biogenesis stages in Arabidopsis root, starting from the youngest cells proximate to the quiescent center. We validate our previous conclusions by demonstrating that the vacuolar dye BCECF is fully suitable for studying the organelle’s morphology and provide 3D models of vacuoles at all developmental stages. Furthermore, we established a customized FRAP assay and proved that even at the earliest stages of biogenesis, vacuoles comprise a connected network. Finally, we summarized the new and pre-existing evidence substantiating that vacuolar structures cannot originate solely from MVBs.

Abstract In the cytosol of plant cells, heat-induced protein aggregates are resolved by ClpB/Hsp100 family member HSP101, which is essential for thermotolerance. For chloroplast family member CLPB3 this is less clear with controversial reports on its role in conferring thermotolerance. To shed light onto this issue, we have characterized two Chlamydomonas reinhardtii clpb3 mutants. We show that chloroplast CLPB3 is required for resolving heat-induced protein aggregates containing stromal TIG1 and the small heat shock proteins HSP22E/F in vivo and for conferring thermotolerance under heat stress. Although CLPB3 accumulates to similarly high levels as stromal HSP70B under ambient conditions, we observed no prominent constitutive phenotypes. However, we found decreased accumulation of the ribosomal subunit PRPL1 and increased accumulation of the stromal protease DEG1C in the clpb3 mutants, suggesting that reduction in chloroplast protein synthesis capacity and increase in protease capacity may compensate for loss of CLPB3 function. Under ambient conditions, CLPB3 was distributed throughout the chloroplast but reorganized into stromal foci upon heat stress, which mostly disappeared during recovery. CLPB3 foci were localized next to signals from HSP22E/F, originating largely to the thylakoid membrane occupied area. This suggests a possible role for CLPB3 in disentangling protein aggregates from the thylakoid membrane system. Highlight Chloroplast CLPB3 in Chlamydomonas is required for resolving heat-induced protein aggregates and this activity confers thermotolerance under severe heat stress. During heat stress, CLPB3 organizes into stromal foci located next to the thylakoid membrane system, indicating a role for CLPB3 in disentangling protein aggregates from there.

Abstract According to their lifestyle, plant pathogens are divided into biotrophic and necrotrophic organisms. While biotrophic pathogens establish a relationship with living host cells, necrotrophic pathogens rapidly kill host cells and feed on the cell debris. To this end, the necrotrophic ascomycete fungus Botrytis cinerea secretes large amounts of phytotoxic proteins and cell wall degrading enzymes. However, the precise role of these proteins during the infection process is unknown. Here we report on the identification and characterization of the previously unknown toxic protein hypersensitive response inducing protein 1 (Hip1), which induces plant cell death. We found the adoption of a folded protein structure to be a prerequisite for Hip1 to exert its necrosis-inducing activity in Nicotiana benthamiana . Localization and the induction of specific plant responses by Hip1 indicate recognition as pathogen-associated molecular pattern at the plant plasma membrane. Our results demonstrate that recognition of Hip1, even in the absence of obvious enzymatic or poreforming activity, induces strong plant defense reactions eventually leading to plant cell death.

Summary The devastating pathogen Botrytis cinerea infects a broad spectrum of host plants, causing great socio‐economic losses. The necrotrophic fungus rapidly kills plant cells, nourishing their wall and cellular contents. To this end, necrotrophs secrete a cocktail of cell wall degrading enzymes, phytotoxic proteins and metabolites. Additionally, many fungi produce specialized invasion organs that generate high invasive pressures to force their way into the plant cell. However, for most necrotrophs, including Botrytis , the biomechanics of penetration and its contribution to virulence are poorly understood. Here, we use a combination of quantitative micromechanical imaging and CRISPR–Cas‐guided mutagenesis to show that Botrytis uses substantial invasive pressure, in combination with strong surface adherence, for penetration. We found that the fungus establishes a unique mechanical geometry of penetration that develops over time during penetration events, and which is actin cytoskeleton dependent. Furthermore, interference of force generation by blocking actin polymerization was found to decrease Botrytis virulence, indicating that also for necrotrophs, mechanical pressure is important in host colonization. Our results demonstrate for the first time mechanistically how a necrotrophic fungus such as Botrytis employs this ‘brute force’ approach, in addition to the secretion of lytic proteins and phytotoxic metabolites, to overcome plant host resistance.

Abstract Botrytis cinerea is a major pathogen of more than 1400 plant species. During infection, the kills host cells during infection and spreads through necrotic tissue, which is believed to be supported by induction of programmed plant cell death. To comprehensively evaluate the contributions of most of the currently known plant cell death inducing proteins (CDIPs) and metabolites for necrotrophic infection, an optimized CRISPR/Cas protocol was established which allowed serial marker-free mutagenesis to generate Botrytis mutants lacking up to 12 different CDIPs. Infection analysis revealed a decrease in virulence with increasing numbers of knockouts, and differences in the effects of knockouts on different host plants. The on planta secretomes obtained from these mutants revealed substantial remaining necrotic activity after infiltration into leaves. Our study has addressed for the first time the functional redundancy of virulence factors of a fungal pathogen, and demonstrates that B. cinerea releases a highly redundant cocktail of proteins and metabolites to achieve necrotrophic infection of a wide variety of host plants.

Pyrimidine de novo synthesis is an essential pathway in all organisms. The final and rate limiting step in the synthesis of the nucleotide CTP is catalyzed by CTP-Synthase (CTPS) and Arabidopsis harbors five isoforms. Single knockouts of each of these do not show apparent phenotypical alterations with the exception of CTPS2. T-DNA insertion lines for this isoform were unable to produce homozygous offspring. Here we show that CTPS2 exhibits a distinct expression pattern throughout embryo development and loss of function mutants were embryo lethal, as siliques from +/ctps2 plants contained nearly 25 % aborted seeds. This phenotype was rescued by complementation with CTPS2 under control of its endogenous promoter. Reporter lines revealed CTPS2 expression only in the tip of columella cells in embryos of the heart and later stages. Furthermore CTPS2 expression in roots, most pronounced in the columella cells, shoots and vasculature tissue of young seedlings was observed. Filial generations of +/ctps2 plants did not germinate properly, even under external cytidine supply. During embryo development CTPS2 expression was similar to the well known auxin reporter DR5. Indeed, the cloned promoter region we used in this study possesses a repeat of an auxin response element. Thus, we conclude that CTPS2 is essential for CTP supply in the developing embryo and a knockout of CTPS2 is embryo lethal.

CRISPR/Cas has become the state-of-the-art technology for genetic manipulation in diverse organisms, enabling targeted genetic changes to be performed with unprecedented efficiency. Here we report on the first establishment of robust CRISPR/Cas editing in the important necrotrophic plant pathogen Botrytis cinerea based on the introduction of optimized Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes (RNPs) into protoplasts. Editing yields were further improved by development of a novel strategy that combines RNP delivery with transiently stable telomeres containing vectors, which allowed temporary selection and convenient screening of marker-free editing. We demonstrate that this approach provides vastly superior editing rates compared to existing CRISPR/Cas-based methods in filamentous fungi, including the model plant pathogen Magnaporthe oryzae. The high performance of telomere vector-mediated coediting was demonstrated by random mutagenesis of codon 272 of the sdhB gene, a major determinant of resistance to succinate dehydrogenase inhibitor (SDHI) fungicides by in bulk replacement of the codon 272 with codons encoding all 20 amino acids. All exchanges were found at similar frequencies in the absence of selection but SDHI selection allowed the identification of novel amino acid substitutions which conferred differential resistance levels towards different SDHI fungicides. The increased efficiency and easy handling of RNP-based cotransformation is expected to greatly facilitate molecular research in B. cinerea and other fungi.

Abstract The devastating pathogen Botrytis cinerea infects a broad spectrum of host plants, causing great socio-economic losses. The necrotrophic fungus rapidly kills plant cells, nourishing their walls and cellular contents. To this end, necrotrophs secretes a cocktail of cell wall degrading enzymes, phytotoxic proteins and metabolites. Additionally, many fungi produce specialized invasion organs that generate high invasive pressures to force their way into the plant cell. However, for most necrotrophs, including Botrytis , the biomechanics of penetration and its contribution to virulence are poorly understood. Here we use a combination of quantitative micromechanical imaging and CRISPR-Cas guided mutagenesis to show that Botrytis uses substantial invasive pressure, in combination with strong surface adherence, for penetration. We found that the fungus establishes a unique mechanical geometry of penetration that develops over time during penetration events, and which is actin cytoskeleton dependent. Furthermore, interference of force generation by blocking actin polymerization was found to decrease Botrytis virulence, indicating that also for necrotrophs, mechanical pressure is important in host colonization. Our results demonstrate for the first time mechanistically how a necrotrophic fungus such as Botrytis employs this “brute force” approach, in addition to the secretion of lytic proteins and phytotoxic metabolites, to overcome plant host resistance.