The immunocompromised are at high risk of prolonged SARS-CoV-2 infection and progression to severe COVID-19. However, efficacy of late-onset direct-acting antiviral (DAA) therapy with therapeutics in clinical use and experimental drugs to mitigate persistent viral replication is unclear. In this study, we employed an immunocompromised mouse model, which supports prolonged replication of SARS-CoV-2 to explore late-onset treatment options. Tandem immuno-depletion of CD4

Summary After years of the COVID-19 pandemic, over 40 million children worldwide are at risk of measles due to delayed vaccination 1 and temporary SARS-CoV-2 viral dominance 2 . Acute measles has a case-fatality rate of ∼1%, but most morbidity and mortality arise post-measles due to destruction of pre-existing immune memory by lymphotropic measles virus (MeV) 3,4 , a paramyxovirus of the Morbillivirus genus. MeV-induced immune amnesia is not mitigated by post-exposure vaccination and the impact of unrelated respiratory virus disease history on measles severity has not been defined. We used a lethal canine distemper virus (CDV)-ferret model as surrogate for human morbillivirus disease 5 and employed the orally efficacious broad-spectrum paramyxovirus polymerase inhibitor GHP-88309 6 to establish measles treatment paradigms. Applying a receptor tropism-intact recombinant CDV with low lethality, we provide in vivo confirmation of the morbillivirus immune amnesia hypothesis and reveal an 8-day advantage of antiviral treatment versus therapeutic vaccination in preserving immune memory. Infection of ferrets with non-lethal influenza A virus (IAV) A/CA/07/2009 (H1N1) or respiratory syncytial virus (RSV) four weeks prior to CDV caused exacerbated CDV disease that rapidly advanced to fatal hemorrhagic pneumonia associated with lung onslaught by commensal bacteria. RNAseq of BAL samples and lung tissue identified CDV-induced expression of trefoil factor (TFF) peptides, which was absent in animals pre-infected with IAV, thus highlighting that immune priming by unrelated respiratory viruses influences morbillivirus infection outcome. Non-invasive pulmonary ferret MRI revealed that severe outcomes of consecutive IAV/CDV infections were prevented by oral GHP-88309 treatment even when initiated after peak clinical signs of CDV. These findings validate the morbillivirus immune amnesia hypothesis, define treatment paradigms for measles, identify prior disease history as risk factor for exacerbated morbillivirus disease, and demonstrate that treating morbillivirus infection with direct-acting oral antivirals provides therapeutic benefit regardless of whether the time window to mitigate primary clinical signs of infection has closed.

Abstract Investigating the influence of intestinal microbiota composition on respiratory viral infection (RVI) revealed that segmented filamentous bacteria (SFB), naturally acquired or exogenously administered, protected mice against influenza virus (IAV) infection, as assessed by viral titers, histopathology, and clinical disease features. Such protection, which also applied to RSV and SARS-CoV-2, was independent of interferon and adaptive immunity but required basally resident alveolar macrophages (AM), which, in SFB-negative mice, were quickly depleted as RVI progressed. Examination of AM from SFB-colonized mice revealed that they were intrinsically altered to resist IAV-induced depletion and inflammatory signaling. Yet, AM from SFB-colonized mice were not quiescent. Rather, they directly disabled IAV via enhanced complement production and phagocytosis. Transplant of SFB-transformed AM into SFB-free hosts recapitulated SFB-mediated protection against IAV mechanistically linking intestinal microbiota, AM phenotype, and RVI severity. One sentence summary Intestinal segmented filamentous bacteria reprogram alveolar macrophages enabling their host to withstand respiratory viruses.

Pre-existing or rapidly emerging resistance of influenza viruses to approved antivirals makes the development of novel therapeutics to mitigate seasonal influenza and improve preparedness against future influenza pandemics an urgent priority. We have recently identified the chain-terminating broad-spectrum nucleoside analog clinical candidate 4-fluorouridine (4-FlU) and demonstrated oral efficacy against seasonal, pandemic, and highly pathogenic avian influenza viruses in the mouse and ferret model. Here, we have resistance-profiled 4-FlU against a pandemic A/CA/07/2009 (H1N1) (CA09). In vitro viral adaptation yielded six independently generated escape lineages with distinct mutations that mediated moderate resistance to 4-FlU in the genetically controlled background of recombinant CA09 (recCA09). Mutations adhered to three distinct structural clusters that are all predicted to affect the geometry of the active site of the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) complex for phosphodiester bond formation. Escape could be achieved through an individual causal mutation, a combination of mutations acting additively, or mutations functioning synergistically. Fitness of all resistant variants was impaired in cell culture, and all were attenuated in the mouse model. Oral 4-FlU administered at lowest-efficacious (2 mg/kg) or elevated (10 mg/kg) dose overcame moderate resistance when mice were inoculated with 10 LD50 units of parental or resistant recCA09, demonstrated by significantly reduced virus load and complete survival. In the ferret model, invasion of the lower respiratory tract by variants representing four adaptation lineages was impaired. Resistant variants were either transmission-incompetent, or spread to untreated sentinels was fully blocked by therapeutic treatment of source animals with 4-FlU.

Abstract Influenza outbreaks are associated with substantial morbidity, mortality and economic burden. Next generation antivirals are needed to treat seasonal infections and prepare against zoonotic spillover of avian influenza viruses with pandemic potential. Having previously identified oral efficacy of the nucleoside analog 4’-Fluorouridine (4’-FlU, EIDD-2749) against SARS-CoV-2 and respiratory syncytial virus, we explored activity of the compound against seasonal and highly pathogenic influenza (HPAI) viruses in cell culture, human airway epithelium organoids, and/or two animal models, ferrets and mice, that assess IAV transmission and lethal viral pneumonia, respectively. 4’-FlU inhibited a panel of relevant influenza A and B viruses with nanomolar potency in organoids. In vitro polymerase assays revealed immediate chain termination of IAV polymerase after 4’-FlU incorporation, in contrast to delayed chain termination of SARS-CoV-2 and RSV polymerase. Once-daily oral treatment of ferrets with 2 mg/kg 4’-FlU initiated 12 hours after infection rapidly stopped virus shedding and prevented direct-contact transmission to untreated sentinels. Treatment of mice infected with a lethal inoculum of pandemic A/CA/07/2009 (H1N1)pdm09 (Ca09) with 2 mg/kg 4’-FlU alleviated pneumonia. Three doses mediated complete survival when treatment was initiated up to 60 hours after infection, indicating an unusually broad window for effective intervention. Therapeutic oral 4’-FlU ensured survival of animals infected with HPAI A/VN/12/2003 (H5N1) and of immunocompromised mice infected with pandemic Ca09. Recoverees were fully protected against homologous reinfection. This study defines the mechanistic foundation for high sensitivity of influenza viruses to 4’-FlU and supports 4’-FlU as developmental candidate for the treatment of seasonal and pandemic influenza. Author Summary Next-generation antiviral therapeutics are needed to better mitigate seasonal influenza and prepare against zoonotic virus spillover from animal reservoirs. At greatest risk are the immunocompromised and patients infected with highly pathogenic influenza viruses. In this study, we have demonstrated efficacy of a broad-spectrum nucleoside analog, 4’-fluorouridine, against a representative panel of influenza viruses in cell culture, human organoids, and two animal models, ferrets and mice. Acting as an immediate chain terminator of the influenza virus polymerase, once-daily oral treatment protected against lethal infection with seasonal and highly pathogenic avian influenza viruses, prevented direct-contact transmission to untreated sentinels, and mitigated lethal infection of immunocompromised hosts. These results support the developmental potential of 4’-fluorouridine for treatment of vulnerable patient groups and mitigation of pandemic influenza, providing a much-needed additional therapeutic option for improved disease management.