Abstract Synucleinopathies form a group of neurodegenerative diseases defined by misfolding and aggregation of alpha-synuclein (α-syn). Abnormal accumulation and spreading of α-syn aggregates lead to synapse dysfunction and neuronal cell death. Yet, little is known about synaptic mechanisms underlying α-syn pathology. Here we identified β-isoforms of neurexins (β-NRXs) as presynaptic organizing proteins that interact with α-syn preformed fibrils (α-syn PFFs), toxic α-syn aggregates, but not α-syn monomers. Our cell surface protein binding assays and surface plasmon resonance assays reveal that α-syn PFFs bind directly to β-NRX through their N-terminal histidine-rich domain (HRD) at nanomolar range (Kd: ~500 nM monomer equivalent). Furthermore, our artificial synapse formation assays show that α-syn PFFs diminish excitatory and inhibitory presynaptic organization induced by a specific isoform of neuroligin 1 that binds only β-NRXs, but not α-isoforms of neurexins. Thus, our data suggest that α-syn PFFs interact with β-NRXs to inhibit β-NRX-mediated presynaptic organization, providing novel molecular insight into how α-syn PFFs induce synaptic pathology in synucleinopathies such as Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies.

Abstract MerTK is a receptor tyrosine kinase that mediates the immunologically silent phagocytic uptake of diverse types of cellular debris. Highly expressed on the surface of microglial cell, MerTK is of importance in brain development, homeostasis, plasticity, and disease. Yet, involvement of this receptor in the clearance of protein aggregates that accumulate with aging and in neurodegenerative diseases has yet to be defined. The current study explored the function of MerTK in the microglial uptake of alpha-synuclein fibrils which play a causative role in the pathobiology of synucleinopathies. Using human primary and induced pluripotent stem cell-derived microglia, the MerTK- dependence of alpha-synuclein fibril internalization was investigated in vitro . Relevance of this pathway to synucleinopathies was assessed by analyzing MerTK expression in patient-derived cells and tissues. Pharmacological inhibition of MerTK and siRNA-mediated MERTK knockdown both caused a decreased rate of alpha-synuclein fibril internalization by human microglia. Consistent with the immunologically silent nature of MerTK-mediated phagocytosis, alpha-synuclein fibril internalization did not induce secretion of pro-inflammatory cytokines from microglia. In addition, burden analysis in two independent patient cohorts revealed a significant association between rare functionally deleterious MERTK variants and Parkinson’s disease in one of the cohorts ( p = 0.002). Accordingly, MERTK expression was significantly upregulated in nigral microglia from Parkinson’s disease/Lewy body dementia patients compared to those from non-neurological control donors in a single-nuclei RNA-sequencing dataset ( p = 5.08 × 10 - 21 ), and MerTK protein expression positively correlated with alpha-synuclein level in human cortex lysates ( p = 0.0029). Taken together, our findings define a novel role for MerTK in mediating the uptake of alpha-synuclein aggregates by human microglia, with possible involvement in limiting alpha-synuclein spread in synucleinopathies such as Parkinson’s disease.

Abstract Autosomal recessive mutations in either PRKN or PINK1 are associated with early-onset Parkinson’s disease. The corresponding proteins, PRKN, an E3 ubiquitin ligase, and the mitochondrial serine/threonine-protein kinase PINK1 play a role in mitochondrial quality control. Using CRISPR/CAS9 technology we generated three human iPSC lines from the well characterized AIW002-02 control line. These isogenic iPSCs contain homozygous knockouts of PRKN (PRKN-KO, CBIGi001-A-1), PINK1 (PINK1-KO, CBIGi001-A-2) or both PINK1 and PRKN (PINK1-KO/PRKN-KO, CBIGi001-A-3). The knockout lines display normal karyotypes, express pluripotency markers and upon differentiation into relevant brain cells or midbrain organoids may be valuable tools to model Parkinson’s disease.

Abstract Alpha-synuclein (aSyn) pathology has been extensively studied in mouse models harbouring human mutations. In spite of the known sex differences in age of onset, prevalence and disease presentation in human synucleinopathies, the impact of sex on aSyn propagation has received very little attention. To address this need, we examined sex differences in whole brain signatures of neurodegeneration due to aSyn toxicity in the M83 mouse model using longitudinal magnetic resonance imaging (MRI; T1-weighted; 100 μm 3 isotropic voxel; acquired −7, 30, 90 and 120 days post-injection [dpi]; n≥8 mice/group/sex/time point). To initiate aSyn spreading, M83 mice were inoculated with recombinant human aSyn preformed fibrils (Hu-PFF) or phosphate buffered saline (PBS) injected in the right dorsal striatum. We observed more aggressive neurodegenerative profiles over time for male M83 Hu-PFF-injected mice when examining voxel-wise trajectories. However, at 90 dpi, we observed widespread patterns of neurodegeneration in the female Hu-PFF-injected mice. These differences were not accompanied with any differences in motor symptom onset between the male and female Hu-PFF-injected mice. However, male Hu-PFF-injected mice reached their humane endpoint sooner. These findings suggest that post-motor symptom onset, even though more accelerated disease trajectories were observed for male Hu-PFF-injected mice, neurodegeneration may appear sooner in female Hu-PFF-injected mice (prior to motor symptomatology). These findings suggest that sex-specific synucleinopathy phenotypes urgently need to be considered to improve our understanding of neuroprotective and neurodegenerative mechanisms.

ABSTRACT TBK1 is a serine-threonine kinase that has been linked to a number of diseases, including amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Reproducible research on TBK1 has been hampered by the lack of well characterized antibodies. In this study, we characterized 11 commercial antibodies for immunoblot, immunofluorescence and immunoprecipitation, using a knock-out cell line as the control. For each application, we identified several potent and selective antibodies that will facilitate studies on TBK1.

Abstract There is significant evidence suggesting aggregated misfolded alpha-synuclein, a major component of Lewy bodies, propagates in a prion-like manner contributing to disease progression in Parkinson’s disease (PD) and other synucleinopathies. Animal models are essential for understanding and developing treatments for these diseases. However, despite modelling human pathology, most endpoints studied in mice do not translate to humans. Furthermore, the progression by which alpha-synuclein misfolding affects human-relevant measures such as brain volume and underlying subtle, high-level cognitive deficits is poorly understood. Here we used a mouse model of synucleinopathy; hemizygous M83 human A53T alpha-synuclein transgenic mice inoculated with recombinant human alpha-synuclein preformed fibrils (PFF) injected in the right striatum to initiate alpha-synuclein misfolding and aggregation. We examined alpha-synuclein-induced atrophy at 90 days post-injection using ex vivo magnetic resonance imaging as well as high-level cognition and motor function, as biomarkers of alpha-synuclein toxicity. We observed widespread atrophy in bilateral regions that project to or receive input from the injection site, highlighting a network of regions that are consistent with structural changes observed in humans with PD. Moreover, we detected early deficits in reversal learning with touchscreen testing in PFF-injected mice prior to motor dysfunction, consistent with the pathology observed in cortical-striatal and thalamic loops. We show, using translational approaches in mice, that progression of prion-like spreading of alpha-synuclein causes selective atrophy via connected brain regions leading to high-level cognitive deficits. We propose that precise imaging and cognitive biomarkers can provide a more direct and human-relevant measurement of alpha-synuclein-induced toxicity in pre-clinical testing. Significance Statement The work described in this manuscript showcases the utility of state-of-the-art methodologies (magnetic resonance imaging and touchscreen behavioural tasks) to examine endophenotypes, both in terms of symptomatology and neuroanatomy, of alpha-synuclein propagation in a mouse model of synucleinopathy. Our work further validates the M83-Hu-PFF mouse model of synucleinopathy-associated pathogenesis of neurodegenerative diseases while highlighting precise imaging and cognitive biomarkers of protein misfolding toxicity. Specifically, we identified rapid and translational biomarkers that can serve as a proxy for the direct examination of cellular levels for pathology. We anticipate that these biomarkers can measure progression of toxicity, specifically in the early phases, and may be more reliable than end stage pathology and more useful as endpoints in the examination of novel therapeutics.

ABSTRACT The USP19 deubiquitinase is found in a locus associated with Parkinson’s Disease (PD), interacts with heat shock proteins and promotes secretion of a-synuclein (a-syn) through the misfolding associated protein secretion (MAPS) pathway. Since these processes might modulate the processing of a-syn aggregates during the progression of PD, we tested the effect of USP19 knockout (KO) in mice expressing the A53T mutation of a-syn and in whom a-syn preformed fibrils (PFF) had been injected in the striatum. Compared to WT, KO brains showed decreased accumulation of phospho-synuclein (pSyn) positive aggregates. The improved pathology was associated with less activation of microglia, higher levels of synaptic marker proteins and improved performance in a tail suspension test. Exposure of primary neurons from WT and KO mice to PFF in vitro also led to decreased accumulation of pSyn aggregates. KO did not affect uptake of PFF in the cultured neurons. It also did not affect the propagation of aggregates as assessed by exposing WT or KO neurons to PFF and measuring pSyn positive aggregates in non-exposed adjacent neurons separated using a microfluidics device. We conclude that USP19 instead modulates intracellular dynamics of aggregates. Indeed, at the early time following PFF injection when the number of pSyn positive neurons were similar in WT and KO brains, the KO neurons contained less aggregates. KO brain aggregates stained more intensely with anti-ubiquitin antibodies. Immunoprecipitation of soluble proteins from primary neurons exposed to PFF with antibodies to ubiquitin or pSyn showed higher levels of ubiquitinated a-syn oligomeric species in the KO neurons. We propose that the improved pathology in USP19 KO brains may arise from decreased formation or enhanced clearance of the more ubiquitinated aggregates and/or enhanced disassembly towards more soluble oligomeric species. USP19 inhibition may represent a novel therapeutic approach that targets the intracellular dynamics of a-syn complexes.

Background: Adult-onset leukoencephalopathy with axonal spheroids and pigmented glia (ALSP) is a primary microgliopathy caused by pathogenic variants in the colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) gene. Since CSF1R signaling is crucial for microglia development, survival and function, induced pluripotent stem cell-derived microglia (iMGL) represent an excellent tool in studying microglial defects caused by ALSP patient-specific CSF1R variants. Methods: Serial modifications to an existing iMGL protocol were made, including but not limited to changes in growth factor combination to drive microglial differentiation, until successful derivation of microglia-like cells from an ALSP patient carrying a c.2350G > A (p.V784M) CSF1R variant. Using healthy control lines, the quality of the new iMGL protocol was validated through cell yield assessment, measurement of microglia marker expression, transcriptomic comparison to primary microglia, and evaluation of inflammatory and phagocytic activities. Similarly, molecular and functional characterization of the ALSP patient-derived iMGL was carried out in comparison to healthy control iMGL. Results: The newly devised protocol allowed the generation of iMGL with enhanced transcriptomic similarity to primary human microglia and with higher phagocytic and inflammatory competence at ~3-fold greater yield compared to the original protocol. Using this protocol, decreased CSF1R autophosphorylation and cell surface expression was observed in iMGL derived from the ALSP patient compared to those derived from healthy controls. Additionally, ALSP patient-derived iMGL presented a migratory defect accompanying a temporal reduction in purinergic receptor P2Y12 (P2RY12) expression. Finally, ALSP patient-derived cells showed surprisingly high phagocytic capacity, which was associated with higher lysosomal content. Conclusions: We optimized a pre-existing iMGL protocol, generating a powerful tool to study microglial involvement in human neurological diseases. Using the optimized protocol, we have generated for the first time iMGL from an ALSP patient carrying a pathogenic CSF1R variant, with preliminary characterization pointing toward functional alterations in migratory and phagocytic activities.

ABSTRACT Synucleinopathies are characterized by the accumulation and propagation of α-synuclein (α-syn) aggregates throughout the brain, leading to neuronal dysfunction and death. Understanding how these aggregates propagate from cell to cell in a prion-like fashion thus holds great therapeutic promises. Here, we focused on understanding the cellular processes involved in the entry and accumulation of pathological α-syn aggregates. We used an unbiased FACS-based genome-wide CRISPR/Cas9 knockout (KO) screening to identify genes that regulate the accumulation of α-syn preformed fibrils (PFFs) in cells. We identified key genes and pathways specifically implicated in α-syn PFFs intracellular accumulation, including heparan sulfate proteoglycans (HSPG) biosynthesis and Golgi trafficking. We show that all confirmed hits affect heparan sulfate (HS), a post-translational modification known to act as a receptor for proteinaceous aggregates including of α-syn and tau. Intriguingly, KO of SLC39A9 and C3orf58 genes, encoding respectively a Golgi-localized exporter of Zn 2+ , and the Golgi-localized putative kinase DIPK2A, specifically impaired the uptake of α-syn PFFs uptake but not of tau oligomers, by preventing the binding of PFFs to the cell surface. Mass spectrometry-based analysis of HS chains indicated major defects in HS maturation in SLC39A9 and C3orf58 KO cells, explaining the cell surface binding deficit. Our findings now clearly establish these two genes as HSPG-modulating factors. Interestingly, C3orf58 KO human iPSC-derived microglia exhibited a strong reduction in their ability to internalize α-syn PFFs. Altogether, our data establish HSPGs as major receptors for α-syn PFFs binding on the cell surface and identifies new players in α-syn PFFs cell surface binding and uptake.

SUMMARY Lewy bodies (LBs), rich in α-synuclein, are a hallmark of Parkinson’s disease (PD). Understanding their biogenesis is likely to provide insight into the pathophysiology of PD, yet a cellular model for LB formation remains elusive. The realization that the immune challenge is a trigger for neurodegenerative diseases has been a breakthrough in the understanding of PD. Here, iPSC-derived human dopaminergic (DA) neurons from multiple healthy donors were found to form LB-like inclusions following treatment with α- synuclein preformed fibrils, but only when coupled to an immune challenge (interferon-gamma or interleukin-1 beta) or when co-cultured with activated microglia. Human cortical neurons derived from the same iPSC lines did not form LB-like inclusions. Exposure to interferon-gamma impairs autophagy in a lysosomal-specific manner in vitro, similar to the disruption of proteostasis pathways that contribute to PD. We find that lysosomal membrane proteins LAMP1 and LAMP2 and transcription factors regulating lysosomal biogenesis and function are downregulated in DA but not cortical neurons. Finally, due to the excellent sample preservation afforded by cells compared to post-mortem PD brain tissue, we conclude that the LB-like inclusions in DA neurons are membrane-bound, suggesting they are not limited to the cytoplasmic compartment. In Brief Bayati et al. identify that iPSC-derived dopaminergic neurons undergoing a dual hit treatment of exogenous α-synuclein fibrils and proinflammatory cytokines form Lewy body-like inclusions. The dual hit treatment also led to the downregulation of lysosomal proteins. Characterization of inclusions revealed that inclusions were membrane-bound and LC3B-positive, suggesting they are dysfunctional autophagosomes. Highlights α-synuclein preformed fibril administration coupled with Interferon-gamma exposure leads dopaminergic neurons to form Lewy body-like inclusions Inclusions are filamentous, membranous, and filled with aberrant organelles Impaired autophagic flux and downregulation of TFEB, NRF2, LAMP1, and LAMP2 correlated with inclusion formation Activation of NRF2 through the treatment of neurons with the antioxidant perillaldehyde, prevents inclusion formation