Abstract DNA determines where and when genes are expressed, but the full set of sequence determinants that control gene expression is not known. To obtain a global and unbiased view of the relative importance of different sequence determinants in gene expression, we measured transcriptional activity of DNA sequences that are in aggregate ∼100 times longer than the human genome in three different cell types. We show that enhancers can be classified to three main types: classical enhancers 1 , closed chromatin enhancers and chromatin-dependent enhancers, which act via different mechanisms and differ in motif content. Transcription factors (TFs) act generally in an additive manner with weak grammar, with classical enhancers increasing expression from promoters by a mechanism that does not involve specific TF-TF interactions. Few TFs are strongly active in a cell, with most activities similar between cell types. Chromatin-dependent enhancers are enriched in forkhead motifs, whereas classical enhancers contain motifs for TFs with strong transactivator domains such as ETS and bZIP; these motifs are also found at transcription start site (TSS)-proximal positions. However, some TFs, such as NRF1 only activate transcription when placed close to the TSS, and others such as YY1 display positional preference with respect to the TSS. TFs can thus be classified into four non-exclusive subtypes based on their transcriptional activity: chromatin opening, enhancing, promoting and TSS determining factors – consistent with the view that the binding motif is the only atomic unit of gene expression.

Abstract Pioneer factors are transcription factors that are important for stem cell pluripotency, cell reprogramming and differentiation, due to their ability to bind to nucleosomes at closed chromatin regions. ELF2 is an ETS family pioneer factor that has a strong preference for oriented binding on nucleosomes (Zhu et al., 2018). On nucleosomes, ELF2 preferentially binds to a composite head-to-tail dimeric motif with a 2 bp spacing between the GGAA core sequences. In this study, we investigated the interaction between ELF2 and a nucleosome using single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) analysis. The ELF2-nucleosome structure shows two ELF2 proteins bound to the nucleosome cooperatively at superhelical location +4. The recognition ⍰4 helices of both ELF2 monomers dock into the major groove of DNA at the core GGAA motifs, and unwrap the nucleosome by approximately four helical turns. The unwrapping almost completely exposes one histone H2A:H2B dimer, which dissociates in a subset of particles to form an ELF2-bound hexasome. Genome-wide mapping of the ELF2 composite motifs shows that they are highly enriched downstream of transcription start sites (TSS), oriented in such a way that the TSS becomes accessible upon ELF2 binding to a nucleosome. ELF2 binding is also expected to increase the inter-nucleosome distance, and recruit chromatin remodelers that can recognize exposed histone surfaces or the hexasome. Our results suggest that ELF2 can open chromatin in an oriented fashion, facilitating chromatin remodeling and transcription initiation.

Abstract Transcription factors bind to DNA by recognizing specific bases within their binding motifs. Binding to each DNA mononucleotide within the motif often contributes independently to total binding energy. However, some transcription factors (TFs) can bind to DNA more specifically than predicted by this model, by directly recognizing DNA dinucleotides. To understand this process, we have solved the structures of the basic helix-loop-helix protein MYF5, and the homeodomain protein BARHL2 together with DNA containing a set of dinucleotides that have different affinities to the proteins at high resolution (< 1 Å). We observe that dinucleotides can be recognized either enthalpically by an extensive water network that connects the adjacent bases to the TF, or entropically by formation of a hydrophobic patch that maintains water mobility at the protein-DNA interface. The two distinct thermodynamic signatures of the two equally optimal sites also confer differential temperature sensitivity to the optimal sites, with implications for thermal regulation of gene expression. Our results uncover the enigma of how TFs can recognize more complex local features than mononucleotides, and demonstrate that water-mediated recognition is important in predicting affinities of macromolecules from their sequence.

Nucleosomes cover most of the genome and are thought to be displaced by transcription factors (TFs) in regions that direct gene expression. However, the modes of interaction between TFs and nucleosomal DNA remain largely unknown. Here, we use nucleosome consecutive affinity-purification systematic evolution of ligands by exponential enrichment (NCAP-SELEX) to systematically explore interactions between the nucleosome and 220 TFs representing diverse structural families. Consistently with earlier observations, we find that the vast majority of TFs have less access to nucleosomal DNA than to free DNA. The motifs recovered from TFs bound to nucleosomal and free DNA are generally similar; however, steric hindrance and scaffolding by the nucleosome result in specific positioning and orientation of the motifs. Many TFs preferentially bind close to the end of nucleosomal DNA, or to periodic positions at its solvent-exposed side. TFs often also bind nucleosomal DNA in a particular orientation, because the nucleosome breaks the local rotational symmetry of DNA. Some TFs also specifically interact with DNA located at the dyad position where only one DNA gyre is wound, whereas other TFs prefer sites spanning two DNA gyres and bind specifically to each of them. Our work reveals striking differences in TF binding to free and nucleosomal DNA, and uncovers a rich interaction landscape between the TFs and the nucleosome.

It is well established that transcription factors (TFs) play crucial roles in determining cell identity, and that a large fraction of all TFs are expressed in most cell types. In order to globally characterize activities of TFs in cells, we have developed a novel massively parallel protein activity assay, Active TF Identification (ATI) that measures DNA-binding activity of all TFs from any species or tissue type. In contrast to previous studies based on mRNA expression or protein abundance, we found that a set of TFs binding to only around ten distinct motifs display strong DNA-binding activity in any given cell or tissue type. Mass spectrometric identification of TFs revealed that within these highly active TFs, there were both housekeeping TFs, which were universally found in all cell types, and specific TFs, which were highly enriched in known factors that determine the fate of the analyzed tissue or cell type. The importance of a small subset of TFs for determining the overall accessible chromatin landscape of a cell suggests that gene regulatory logic may be simpler than what has previously been appreciated.

Sequence specific RNA-binding proteins (RBPs) control many important processes affecting gene expression. They regulate RNA metabolism at multiple levels, by affecting splicing of nascent transcripts, RNA folding, base modification, transport, localization, translation and stability. Despite their central role in most aspects of RNA metabolism and function, most RBP binding specificities remain unknown or incompletely defined. To address this, we have assembled a genome-scale collection of RBPs and their RNA binding domains (RBDs), and assessed their specificities using high throughput RNA-SELEX (HTR-SELEX). Approximately 70% of RBPs for which we obtained a motif bound to short linear sequences, whereas ~30% preferred structured motifs folding into stem-loops. We also found that many RBPs can bind to multiple distinctly different motifs. Analysis of the matches of the motifs in human genomic sequences suggested novel roles for many RBPs. We found that three cytoplasmic proteins, ZC3H12A, ZC3H12B and ZC3H12C bound to motifs resembling the splice donor sequence, suggesting that these proteins are involved in degradation of cytoplasmic viral and/or unspliced transcripts. Surprisingly, structural analysis revealed that the RNA motif was not bound by the conventional C3H1 RNA-binding domain of ZC3H12B. Instead, the RNA motif was bound by the ZC3H12B′s PilT N-terminus (PIN) RNase domain, revealing a potential mechanism by which unconventional RNA binding domains containing active sites or molecule-binding pockets could interact with short, structured RNA molecules. Our collection containing 145 high resolution binding specificity models for 86 RBPs is the largest systematic resource for the analysis of human RBPs, and will greatly facilitate future analysis of the various biological roles of this important class of proteins.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.