Abstract: In many CNS regions, neuronal birth timing is associated with circuit membership. In Drosophila larvae, we show U motor neurons are a temporal cohort—a set of non-identical, contiguously-born neurons from a single neuronal stem cell that contribute to the same circuit. We prolong expression of a temporal transcription factor, Hunchback, to increase the number of U motor neurons with early-born molecular identities. On the circuit level, this expands and re-wires the U motor neuron temporal cohort. On the cell biological level, we find novel roles for Hunchback in motor neuron target selection, neuromuscular synapse formation, dendrite morphogenesis, and behavior. These data provide insight into the relationship between stem cell and circuit, show that Hunchback is a potent regulator of circuit assembly, and suggest that temporal transcription factors are molecules that could be altered during evolution or biomedical intervention for the generation of novel circuits.

Direct measurement of neural activity in freely moving animals is essential for understanding how the brain controls and represents behaviors. Genetically encoded calcium indicators report neural activity as changes in fluorescence intensity, but brain motion confounds quantitative measurement of fluorescence. Translation, rotation, and deformation of the brain and the movements of intervening scattering or auto-fluorescent tissue all alter the amount of fluorescent light captured by a microscope. Compared to single-photon approaches, two photon microscopy is less sensitive to scattering and off-target fluorescence, but more sensitive to motion, and two photon imaging has always required anchoring the microscope to the brain. We developed a closed-loop resonant axial-scanning high-speed two photon (CRASH2p) microscope for real-time 3D motion correction in unrestrained animals, without implantation of reference markers. We complemented CRASH2p with a novel scanning strategy and a multi-stage registration pipeline. We performed volumetric ratiometrically corrected functional imaging in the CNS of freely moving Drosophila larvae and discovered previously unknown neural correlates of behavior.

Neurons exhibit some of the most striking examples of morphological diversity of any cell type. Thus, when studying neurons, the morphology of each neuron must be considered individually. However, neurons densely populate the central nervous system (CNS), making it difficult to ascertain fine morphological features due to a lack of spatial resolution. In

In animals, movement is generated by the activity of motor circuits housed in the vertebrate spinal cord or the arthropod nerve cord. How motor circuits form is a fundamental question, with wide-ranging impacts on the fields of development, neurobiology, medicine, evolution, and beyond. Until recently, studying circuit assembly had been experimentally difficult, with a paucity of suitable models. Due to the introduction of novel neuroscience tools (calcium imaging, optogenetics, connectomics),

In the

Larvae of the fruit fly

How to respond to starvation determines fitness. One prominent behavioral response is increased locomotor activities upon starvation, also known as Starvation-Induced Hyperactivity (SIH). SIH is paradoxical as it promotes food seeking but also increases energy expenditure. Either too much or too little SIH would impair fitness. Despite its importance, the genetic contributions to SIH as a behavioral trait remains unexplored. Here, we examined SIH in the Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) and performed genome-wide association studies. We identified 27 significant loci, corresponding to 18 genes, significantly associated with SIH in adult Drosophila. Gene enrichment analyses indicated that genes encoding ion channels and mRNA binding proteins (RBPs) were most enriched in SIH. We are especially interested in RBPs because they provide a potential mechanism to quickly change protein expression in response to environmental challenges. Using RNA interference, we validated the role of Syp in regulating SIH. Syp encodes Syncrip, an RBP. While ubiquitous knockdown of Syp led to lethality during development, adult flies with neuron specific Syp knockdown were viable and exhibited decreased SIH. Using the Temporal and Regional Gene Expression Targeting (TARGET) system, we further confirmed the role of Syp in adult neurons in regulating SIH. Lastly, RNA-seq analyses revealed that Syp was alternatively spliced under starvation while its expression level was unchanged. Together, this study not only demonstrates genetic contributions to SIH as an important behavioral trait but also highlights the significance of RBPs and post-transcriptional processes in regulating SIH.

Abstract Understanding how circuits self-assemble starting from neuronal stem cells is a fundamental question in developmental biology. Here, we addressed how neurons from different lineages wire with each other to form a specific circuit motif. To do so, we combined developmental genetics—Twin spot MARCM, Multi-color Flip Out, permanent labeling—with circuit analysis—calcium imaging, connectomics, and network science analyses. We find many lineages are organized into temporal cohorts, which are sets of lineage-related neurons born within a tight time window, and that temporal cohort boundaries have sharp transitions in patterns of input connectivity. We identify a feed-forward circuit motif that encodes the onset of vibration stimuli. This feed-forward circuit motif is assembled by preferential connectivity between temporal cohorts from different neuronal stem cell lineages. Further, connectivity does not follow the often-cited early-to-early, late-to-late model. Instead, the feed-forward motif is formed by sequential addition of temporal cohorts, with circuit output neurons born before circuit input neurons. Further, we generate multiple new tools for the fly community. Ultimately, our data suggest that sequential addition of neurons (with outputs neurons being oldest and input neurons being youngest) could be a fundamental strategy for assembling feed-forward circuits.

Previously, using the Drosophila motor system as a model, we found the classic temporal transcription factor, Hunchback acts in NB7-1 neuronal stem cells as a molecular switch to control which circuits are populated by NB7-1 neuronal progeny (Meng et al., 2019). Here, we manipulate cardinal transcription factors, Nkx6 and Hb9, which are candidate effectors of Hunchback and which alter axon pathfinding. Yet manipulation of these cardinal transcription factors does not permanently alter neuromuscular synaptic partnerships. This demonstrating compensation can correct for early defects. We perform additional temporal transcription factor manipulations, precociously expressing Pdm and Castor in NB7-1 and prolonging expression of Hunchback in NB3-1. In every case, we find permanent alterations neuromuscular synaptic partnerships. These data support the idea that temporal transcription factors are uniquely potent determinants of circuit membership, which do not trigger compensatory programs because they act to establish the expected pattern of wiring for the motor system.

Drosophila Transmembrane channel-like (Tmc) is a protein that functions in larval proprioception. The closely related TMC1 protein is required for mammalian hearing, and is a pore forming subunit of the hair cell mechanotransduction channel. In hair cells, TMC1 is gated by small deflections of microvilli that produce tension on extracellular tip-links that connect adjacent villi. How Tmc might be gated in larval proprioceptors, which are neurons having a morphology that is completely distinct from hair cells, is unknown. Here, we have used high-speed confocal microscopy to both measure displacements of proprioceptive sensory dendrites during larval movement, and to optically measure neural activity of the moving proprioceptors. Unexpectedly, the pattern of dendrite deformation for distinct neurons was unique and differed depending on the direction of locomotion: ddaE neuron dendrites were strongly curved by forward locomotion while the dendrites of ddaD were more strongly deformed by backward locomotion. Furthermore, GCaMP6f calcium signals recorded in the proprioceptive neurons during locomotion indicated tuning to the direction of movement. ddaE showed strong activation during forward locomotion while ddaD showed responses that were strongest during backwards locomotion. Peripheral proprioceptive neurons in animals mutant for Tmc showed a near complete loss of movement related calcium signals. As the strength of the responses of wild type animals was correlated with dendrite curvature, we propose that Tmc channels may be activated by membrane curvature in dendrites that are exposed to strain. Our findings begin to explain how distinct cellular systems rely on a common molecular pathway for mechanosensory responses.