Abstract Summary: A typical prokaryote population sequencing study can now consist of hundreds or thousands of isolates. Interrogating these datasets can provide detailed insights into the genetic structure of prokaryotic genomes. We introduce Roary, a tool that rapidly builds large-scale pan genomes, identifying the core and accessory genes. Roary makes construction of the pan genome of thousands of prokaryote samples possible on a standard desktop without compromising on the accuracy of results. Using a single CPU Roary can produce a pan genome consisting of 1000 isolates in 4.5 hours using 13 GB of RAM, with further speedups possible using multiple processors. Availability and implementation: Roary is implemented in Perl and is freely available under an open source GPLv3 license from http://sanger-pathogens.github.io/Roary Contact: roary@sanger.ac.uk Supplementary information: Supplementary data are available at Bioinformatics online.

ABSTRACT Antibiotic resistance is a major problem in Salmonella enterica serovar Typhi, the causative agent of typhoid. Multidrug-resistant (MDR) isolates are prevalent in parts of Asia and Africa and are often associated with the dominant H58 haplotype. Reduced susceptibility to fluoroquinolones is also widespread, and sporadic cases of resistance to third-generation cephalosporins or azithromycin have also been reported. Here, we report the first large-scale emergence and spread of a novel S . Typhi clone harboring resistance to three first-line drugs (chloramphenicol, ampicillin, and trimethoprim-sulfamethoxazole) as well as fluoroquinolones and third-generation cephalosporins in Sindh, Pakistan, which we classify as extensively drug resistant (XDR). Over 300 XDR typhoid cases have emerged in Sindh, Pakistan, since November 2016. Additionally, a single case of travel-associated XDR typhoid has recently been identified in the United Kingdom. Whole-genome sequencing of over 80 of the XDR isolates revealed remarkable genetic clonality and sequence conservation, identified a large number of resistance determinants, and showed that these isolates were of haplotype H58. The XDR S . Typhi clone encodes a chromosomally located resistance region and harbors a plasmid encoding additional resistance elements, including the bla CTX-M-15 extended-spectrum β-lactamase, and carrying the qnrS fluoroquinolone resistance gene. This antibiotic resistance-associated IncY plasmid exhibited high sequence identity to plasmids found in other enteric bacteria isolated from widely distributed geographic locations. This study highlights three concerning problems: the receding antibiotic arsenal for typhoid treatment, the ability of S . Typhi to transform from MDR to XDR in a single step by acquisition of a plasmid, and the ability of XDR clones to spread globally. IMPORTANCE Typhoid fever is a severe disease caused by the Gram-negative bacterium Salmonella enterica serovar Typhi. Antibiotic-resistant S . Typhi strains have become increasingly common. Here, we report the first large-scale emergence and spread of a novel extensively drug-resistant (XDR) S . Typhi clone in Sindh, Pakistan. The XDR S . Typhi is resistant to the majority of drugs available for the treatment of typhoid fever. This study highlights the evolving threat of antibiotic resistance in S . Typhi and the value of antibiotic susceptibility testing and whole-genome sequencing in understanding emerging infectious diseases. We genetically characterized the XDR S . Typhi to investigate the phylogenetic relationship between these isolates and a global collection of S . Typhi isolates and to identify multiple genes linked to antibiotic resistance. This S . Typhi clone harbored a promiscuous antibiotic resistance plasmid previously identified in other enteric bacteria. The increasing antibiotic resistance in S . Typhi observed here adds urgency to the need for typhoid prevention measures.

Vanessa Wong and colleagues report whole-genome sequencing of 1,832 Salmonella enterica serovar Typhi isolates from 63 endemic countries. They identify mutations that define the multidrug resistant (MDR) H58 lineage and report numerous inter- and intracontinental transmissions of this lineage as well as an ongoing MDR typhoid epidemic in Africa. The emergence of multidrug-resistant (MDR) typhoid is a major global health threat affecting many countries where the disease is endemic. Here whole-genome sequence analysis of 1,832 Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) identifies a single dominant MDR lineage, H58, that has emerged and spread throughout Asia and Africa over the last 30 years. Our analysis identifies numerous transmissions of H58, including multiple transfers from Asia to Africa and an ongoing, unrecognized MDR epidemic within Africa itself. Notably, our analysis indicates that H58 lineages are displacing antibiotic-sensitive isolates, transforming the global population structure of this pathogen. H58 isolates can harbor a complex MDR element residing either on transmissible IncHI1 plasmids or within multiple chromosomal integration sites. We also identify new mutations that define the H58 lineage. This phylogeographical analysis provides a framework to facilitate global management of MDR typhoid and is applicable to similar MDR lineages emerging in other bacterial species.

Abstract Background Microbial whole-genome sequencing (WGS) is now increasingly used to inform public health investigations of infectious disease. This approach has transformed our understanding of the global population structure of Salmonella enterica serovar Typhi ( S. Typhi), the causative agent of typhoid fever. WGS has been particularly informative for understanding the global spread of multi-drug resistant (MDR) typhoid. As WGS capacity becomes more decentralised, there is a growing opportunity for collaboration and sharing of surveillance data within and between countries to inform disease control policies. This requires freely available, community driven tools that reduce the barriers to access genomic data for public health surveillance and that deliver genomic data on a global scale. Methods Here we present the Pathogenwatch ( https://pathogen.watch/styphi ) scheme for S. Typhi, a web application enabling the rapid identification of genomic markers of antimicrobial resistance (AMR) and contextualization with public genomic data to identify high-risk clones at a population level. Data are delivered in single genome reports or in collections of genomes combined with geographic and other data using trees, maps and tables. Results We show that the clustering of S. Typhi genomes in Pathogenwatch is comparable to established bioinformatics methods, and that genomic predictions of AMR are largely concordant with phenotypic drug susceptibility data. We demonstrate the public health utility of Pathogenwatch with examples selected from over 4,300 public genomes available in the application. Conclusions Pathogenwatch democratises genomic epidemiology of S. Typhi by providing an intuitive entry point for the analysis of WGS and linked epidemiological data, enabling international public health monitoring of the emergence and spread of high risk clones.

Abstract Background Between 18 September 2023 and 27 October 2023, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust (CUH) partook in the UK Health Security Agency (UKHSA) National Point Prevalence Survey (PPS) of healthcare-associated infections, antimicrobial use and stewardship. This survey was the first to assess the appropriateness of individual antimicrobial prescriptions. Objectives To use the data collected during the PPS to identify antimicrobial agents associated with inappropriate prescribing at CUH and investigate the factors contributing to this trend. Methods Using the UKHSA PPS protocol, data pertaining to antimicrobial prescriptions at CUH during the survey period were collected. All prescriptions captured in the PPS with an associated appropriateness score were analysed. Grouping prescriptions by individual antimicrobial agent allowed identification of antimicrobial agents with a statistically significant proportion of ‘inappropriate’ prescriptions. Further analysis of the prescriptions of these agents, using the PPS data, permitted identification of factors which contributed to this association. Results A total of 1064 patient reviews were conducted on 51 wards. Overall, 477/1064 (45%) of patients were on antimicrobials (mean number of antimicrobial prescriptions per patient=0.7, SD=0.7). Of the 52 agents used, co-amoxiclav (n=147, 19%), piperacillin/tazobactam (n=86, 11%), fluconazole (n=45, 6%) and sulfamethoxazole/trimethoprim (n=44, 6%) were the commonest. Appropriateness was assessed for 565 (79.5%) of the 711 antimicrobial prescriptions with 488 (86.4%) considered appropriate and 77 (13.6%) inappropriate. Co-amoxiclav was identified as the only antimicrobial agent with a statistically significant association with inappropriate prescribing (P<0.001, OR 2.9, 95% CI 1.7–4.8). Further analysis revealed that co-amoxiclav prescriptions for treatment were, relative to other antimicrobials, less likely to adhere to either national or local guidelines (P=0.006, OR 0.4, 95% CI 0.2–0.8) and significantly more likely to be prescribed to treat a condition which does not require antimicrobials (P=0.004, OR 0.3, 95% CI 0.1–0.7) and to treat an infection which required a broader spectrum agent (P<0.001, OR 0.2, 95% CI 0.1–0.5). Conclusions Co-amoxiclav was most commonly associated with misuse/overuse and efforts to improve prescribing at CUH should focus on this agent. Further work is required to understand the factors that drive this association in order to improve prescribing.

A typical prokaryote population sequencing study can now consist of hundreds or thousands of isolates. Interrogating these datasets can provide detailed insights into the genetic structure of of prokaryotic genomes. We introduce Roary, a tool that rapidly builds large-scale pan genomes, identifying the core and dispensable accessory genes. Roary makes construction of the pan genome of thousands of prokaryote samples possible on a standard desktop without compromising on the accuracy of results. Using a single CPU Roary can produce a pan genome consisting of 1000 isolates in 4.5 hours using 13 GB of RAM, with further speedups possible using multiple processors.