Abstract The epigenetic modifications of histones are essential markers related to the development and pathogenesis of diseases, including human cancers. Mapping histone modification has emerged as the widely used tool for studying epigenetic regulation. However, existing approaches are limited by fragmentation and short-read sequencing represent the average chromatin status in samples and cannot provide information about the long-range chromatin states. We leveraged the advantage of long read sequencing to develop a method “BIND&MODIFY” for profiling the histone modification of individual DNA fibers. Our approach is based on the recombinant fused protein A-M.EcoGII, which tethers the methyltransferase M.EcoGII to the protein binding sites and locally labels the neighboring DNA regions through artificial methylations. We demonstrated that the aggregated BIND&MODIFY signal matches the bulk-level ChIP-seq and CUT&TAG, verify the single-molecule heterogenous histone modification status, and quantify the correlation between distal elements. This method could be an essential tool in future third-generation sequencing ages.

Abstract As the genome is organized into a three-dimensional structure in intracellular space, epigenomic information also has a complex spatial arrangement. However, most epigenetic studies describe locations of methylation marks, chromatin accessibility regions, and histone modifications in the horizontal dimension. Proper spatial epigenomic information has rarely been obtained. In this study, we designed spatial chromatin accessibility sequencing (SCA-seq) to resolve the genome conformation by capturing the epigenetic information in single-molecular resolution while simultaneously resolving the genome conformation. Using SCA-seq, we are able to examine the spatial interaction of chromatin accessibility (e.g. enhancer-promoter contacts), CpG island methylation, and spatial insulating functions of the CCCTC-binding factor. We demonstrate that SCA-seq paves the way to explore the mechanism of epigenetic interactions and extends our knowledge in 3D packaging of DNA in the nucleus.

Abstract Conventional approaches to studying 5mC marks in single cells or samples with picogram input DNA amounts usually suffer from low genome coverage due to DNA degradation. Many methods have been developed to optimize the library construction efficiency for bisulfite-treated DNA. However, most of these approaches ignored the amplification bias of bisulfite-treated DNA, which leads to shallow genome coverage. In this study, we developed the T7-assisted enzymatic methyl-sequencing method (TEAM-seq), which adopts enzymatic conversion to minimize DNA degradation and T7 polymerase-assisted unbiased amplification. We demonstrate that TEAM-seq delivered, to the best of our knowledge, the highest reported coverage(70% for 100pg, 35% for 20pg) of single cell genomes in whole-genome 5mC sequencing.

Abstract The concept of RNA velocity has been recently developed that allowed to look at the otherwise static single-cell RNA sequencing data in a dynamic way, which permitted inferences about cell fates. However, the more precise parameters, such as the number of exons/introns, can also be determined using long-read methods. Comparing the numbers of exons and introns allows including more genes for downstream velocity analysis and resolves the precise cell fate. The recently developed concept of “RNA velocity” concerns with dynamic changes in mRNA expression and complements single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data, which are static snapshots of a certain cell state taken at a given time point 1 . RNA velocity measures the change in mRNA abundance by differentiating the newly transcribed unspliced pre-mRNAs from mature spliced mRNAs. The rapidly developing long-read sequencing technology lends itself for RNA velocity analysis of scRNA-seq data, which was previously performed primarily using second-generation sequencing.

Abstract Coordinated gastric smooth muscle contraction is critical for proper digestion and is adversely affected by a number of gastric motility disorders. In this study we report that the secreted protein Mfge8 (milk fat globule-EGF factor 8) inhibits the contractile responses of human gastric antrum muscles to cholinergic stimuli by reducing the inhibitory phosphorylation of the MYPT1 (myosin phosphatase-targeting subunit 1) subunit of MLCP (myosin light chain phosphatase), resulting in reduced LC20 (smooth muscle myosin regulatory light chain 2) phosphorylation. We show that endogenous Mfge8 is bound to its receptor, α8β1 integrin, in human gastric antrum muscles, suggesting that human gastric antrum muscle mechanical responses are regulated by Mfge8. The regulation of gastric antrum smooth muscles by Mfge8 and α8 integrin functions as a brake on gastric antrum mechanical activities. Further studies of the role of Mfge8 and α8 integrin in regulating gastric antrum function will likely reveal additional novel aspects of gastric smooth muscle motility mechanisms.

The molecular mechanism underlying epigenetic inheritance remains largely unknown. Previous studies have shown that transmission of paternal acquired traits through the male germline (i.e., sperm) requires functional DNMT2 to maintain normal profiles of sperm-borne tRNA-derived small RNAs (tsRNAs). Here we report that maternal transmission of a Kit paramutant phenotype (white tail tip) through the female germline (i.e., oocytes) also requires normal function of DNMT2 and normal profiles of DNMT2-dependent tsRNAs and other small noncoding RNAs (sncRNAs) in sperm. Specifically, ablation of DNMT2 leads to aberrant profiles of tsRNAs and other sncRNAs in sperm, which correlate with drastically dysregulated mRNA transcriptome in pronuclear zygotes derived from oocytes carrying the Kit paramutation and a complete blockage of transmission of the paramutant phenotype through the oocytes. Together with previous reports, the present study suggests that both paternal and maternal transmission of epigenetic phenotypes requires DNMT2-dependent tsRNAs in sperm.

Abstract Although extrachromosomal DNA (ecDNA) has been intensively studied for several decades, the mechanisms underlying its tumorigenic effects have been revealed only recently. In the majority of conventional sequencing studies, the high-throughput short-read sequencing largely ignores the epigenetic status of most ecDNA regions except for the junctional areas. Here, we developed the sequencing of enzyme-accessible chromatin in circular DNA (CCDA-seq) method, which uses methylase to label open chromatin without fragmentation and exonuclease to enrich the ecDNA sequencing depth, followed by long-read nanopore sequencing. Using CCDA-seq, we observed significantly different patterns in nucleosome/regulator binding in ecDNA at a single-molecule resolution. These results deepen the understanding of ecDNA regulatory mechanisms.

SncRNA-Seq has become a routine for sncRNA profiling; however, software packages currently available are either exclusively for miRNA or piRNA annotation (e.g., miRDeep, miRanalyzer, Shortstack, PIANO), or for direct mapping of the sequence reads to the genome (e.g., Bowtie 2, SOAP and BWA), which tend to generate inaccurate counting due to repetitive matches to the genome or sncRNA homologs. Moreover, novel sncRNA variants in the sequencing reads, including those bearing small overhangs or internal insertions, deletions or mutations, are totally excluded from counting by these algorithms, leading to potential quantification bias. To overcome these problems, a comprehensive software package that can annotate all known small RNA species with adjustable tolerance towards small mismatches is needed. AASRA is based on our unique anchor alignment algorithm, which not only avoids repetitive or ambiguous counting, but also distinguishes mature miRNA from precursor miRNA reads. Compared to all existing pipelines for small RNA annotation, AASRA is superior in the following aspects: 1) AASRA can annotate all known sncRNA species simultaneously with the capability of distinguishing mature and precursor miRNAs; 2) AASRA can identify and allow for inclusion of sncRNA variants with small overhangs and/or internal insertions/deletions into the final counts; 3) AASRA is the fastest among all small RNA annotation pipelines tested. AASRA represents an all-in-one sncRNA annotation pipeline, which allows for high-speed, simultaneous annotation of all known sncRNA species with the capability to distinguish mature from precursor miRNAs, and to identify novel sncRNA variants in the sncRNA-Seq sequencing reads.

In a trapped-ion system, accurate thermometry of ions is crucial for precisely evaluating the system state and performing quantum operations. However, when the motional state of a single ion is far away from the ground state, the spatial dimensionality of the phonon state sharply increases. Then it is difficult to realize accurate and mode-resolved thermometry with existing methods. In this work, we apply deep learning to the thermometry of a trapped ion and propose an efficient and mode-resolved method for accurately estimating large mean phonon numbers. We have also conducted experimental verification based on a self-developed surface trap. The result has shown the significant accuracy and efficiency of the method for thermometry of a single ion with large mean phonon numbers. The mode-resolved feature of our method makes it better applied to the characterization of system parameters, such as evaluating cooling effectiveness and analyzing surface trap noise. Our trained neural network model can be easily extended to other experimental setups and parameter ranges without modification of the experimental setups.

Hundreds of thousands of putative circular RNAs have been identified through deep sequencing and bioinformatic analyses. However, the circularity of these putative RNA circles has not been experimentally validated due to limited methodologies currently available. We reported here that the template-switching capability of commonly used reverse transcriptases (e.g., SuperScript II) leads to the formation of artificial junction sequences, and consequently misclassification of large linear RNAs as RNA circles. Use of reverse transcriptases without terminal transferase activity (e.g., MonsterScript) for cDNA synthesis is critical for the identification of physiological circular RNAs. We also report two methods, MonsterScript junction PCR and high-resolution melting curve analyses, which can reliably distinguish circular RNAs from their linear forms and thus, can be used to discover and validate true circular RNAs.