SUMMARY The prevalence of Parkinson’s disease (PD) is increasing but the development of novel treatment strategies and therapeutics altering the course of the disease would benefit from specific, sensitive and non-invasive biomarkers to detect PD early. Here, we describe a scalable and sensitive mass spectrometry (MS)-based proteomic workflow for urinary proteome profiling. Our workflow enabled the reproducible quantification of more than 2,000 proteins in more than 200 urine samples using minimal volumes from two independent patient cohorts. The urinary proteome was significantly different between PD patients and healthy controls, as well as between LRRK2 G2019S carriers and non-carriers in both cohorts. Interestingly, our data revealed lysosomal dysregulation in individuals with the LRRK2 G2019S mutation. When combined with machine learning, the urinary proteome data alone was sufficient to classify mutation status and disease manifestation in mutation carriers remarkably well, identifying VGF, ENPEP and other PD-associated proteins as the most discriminating features. Taken together, our results validate urinary proteomics as a valuable strategy for biomarker discovery and patient stratification in PD.

Abstract Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurological disorder that manifests clinically as alterations in movement (bradykinesia, postural instability, loss of balance, and resting tremors) as well as multiple non-motor symptoms including but not limited to cognitive and autonomic abnormalities. Mitochondrial dysfunction has been linked to sporadic PD and loss-of-function mutations in genes encoding the ubiquitin E3 ligase Parkin and protein kinase, PTEN-induced kinase 1 (PINK1), that regulate mitophagy, are causal for familial and juvenile PD 1-3 . Among several therapeutic approaches being explored to treat or improve PD patient’s prognosis, the use of small molecules able to reinstate or boost Parkin activity represents a potential pharmacological treatment strategy 4 . A major barrier is the lack of high throughput platforms based on robust and accurate quantification of Parkin activity in vitro . Here we present two different and complementary Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) based approaches for the quantification of Parkin E3 ligase activity in vitro . These methods recapitulate distinct aspects of ubiquitin conjugation: Parkin auto-ubiquitylation and Parkin-catalysed discharge on lysine residues. Both approaches are scalable for high-throughput primary screening to facilitate the identification of Parkin modulators.

Human genetic variants predicted to cause loss-of-function of protein-coding genes (pLoF variants) provide natural in vivo models of human gene inactivation, and can be valuable indicators of gene function and the potential toxicity of therapeutic inhibitors targeting these genes[1][1],[2][2]. Gain-of-kinase-function variants in LRRK2 are known to significantly increase the risk of Parkinson’s disease[3][3],[4][4], suggesting that inhibition of LRRK2 kinase activity is a promising therapeutic strategy. While preclinical studies in model organisms have raised some on-target toxicity concerns[5][5]–[8][6], the biological consequences of LRRK2 inhibition have not been well-characterized in humans. Here we systematically analyse pLoF variants in LRRK2 observed across 141,456 individuals sequenced in the Genome Aggregation Database (gnomAD)[9][7], 49,960 exome sequenced individuals from the UK Biobank, and over 4 million participants in the 23andMe genotyped dataset. After stringent variant curation, we identify 1,455 individuals with high-confidence pLoF variants in LRRK2 , 82.5% with experimental validation. We show that heterozygous pLoF variants in LRRK2 reduce LRRK2 protein levels but are not strongly associated with reduced life expectancy, or with any specific phenotype or disease state. These data suggest that therapeutics that partially downregulate LRRK2 levels or kinase activity are unlikely to have major on-target safety liabilities. Our results demonstrate the value of large-scale genomic databases and phenotyping of human LoF carriers for target validation in drug discovery. [1]: #ref-1 [2]: #ref-2 [3]: #ref-3 [4]: #ref-4 [5]: #ref-5 [6]: #ref-8 [7]: #ref-9

ABSTRACT Background The endo-lysosomal phospholipid, bis(monoacylglycerol)phosphate (BMP), is aberrantly high in the urine of Parkinson’s patients with mutations in genes encoding leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) and glucocerebrosidase (GCase). Because BMP resides on and regulates the biogenesis of endo-lysosomal intralumenal membranes (exosomes when released), we hypothesized that elevated urinary BMP may be driven by increased exocytosis of BMP-enriched exosomes. Objective Our aim was to explore the contribution of LRRK2 and GCase activities in the regulation of BMP metabolism and release. Methods Microscopy and biochemical assays were used to analyze antibody-accessible BMP and exosome release in wild type (WT) and R1441G LRRK2–expressing mouse embryonic fibroblast cells. Lipidomics analysis was conducted to measure BMP and lipid content in cells and isolated exosomes. In these experiments, we tested the effects of LRRK2 and GCase inhibitors, MLi-2 and conduritol β-epoxide respectively, to assess regulation of BMP by LRRK2 and GCase. Results Alterations in antibody-accessible BMP and endo-lysosome morphology were detected in R1441G LRRK2 cells. Lipidomics analysis revealed increased BMP content in mutant LRRK2 MEFs compared to WT MEFs. Inhibition of LRRK2 partially restored cellular and exosome-associated BMP levels; abrogation of GCase activity had the opposite effect. Metabolic labeling experiments confirmed that BMP synthesis is not influenced by LRRK2 or GCase activities. Pharmacological modulation of exosome release further confirmed exosome-mediated BMP exocytosis. Conclusions LRRK2 regulates BMP in cells and its release in exosomes, which can be further modulated by GCase activity. These results have implications for the use of exosomal BMP as a Parkinson’s disease biomarker.

The phosphorylated form of LRRK2, pS935 LRRK2, has been proposed as a target modulation biomarker for LRRK2 inhibitors. To qualify the biomarker for therapeutic trials, we assessed pS935 LRRK2 levels in Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs). Analyses of PBMCs from healthy controls, idiopathic Parkinson's disease (iPD), and G2019S carriers with and without PD showed significant reductions in pS935 LRRK2 levels normalized to total LRRK2 levels in G2019S carriers with PD compared to those without PD or iPD. Neither analyte correlated with age, gender, or disease severity. Thus, pS935 LRRK2 in PBMCs may reflect a state marker for G2019S LRRK2-driven PD.

SUMMARY Parkinson’s disease (PD) is a growing burden worldwide, and despite ongoing efforts to find reliable biomarkers for early and differential diagnosis, prognosis and disease monitoring, there is no biofluid biomarker used in clinical routine to date. Cerebrospinal fluid (CSF) is collected often and should closely reflect structural and functional alterations in PD patients’ brains. Here we describe a scalable and sensitive mass spectrometry (MS)-based proteomics workflow for CSF proteome profiling to find specific biomarkers and identify disease-related changes in CSF protein levels in PD. From two independent cohorts consisting of more than 200 individuals, our workflow reproducibly quantified over 1,700 proteins from minimal sample amounts. Combined with machine learning, this identified a group of several proteins, including OMD, CD44, VGF, PRL, and MAN2B1 that were altered in PD patients or significantly correlate with clinical scores, indicative of disease progression. Interestingly, we uncovered signatures of enhanced neuroinflammation in patients with familial PD (LRRK2 G2019S carriers) as indicated by increased levels of CTSS, PLD4, HLA-DRA, HLA-DRB1, and HLA-DPA1. A comparison with urinary proteome changes in PD patients revealed a large overlap in protein composition PD-associated changes in these body fluids, including lysosomal factors like CTSS. Our results validate MS-based proteomics of CSF as a valuable strategy for biomarker discovery and patient stratification in a neurodegenerative disease like PD. Consistent proteomic signatures across two independent CSF cohorts and previously acquired urinary proteome profiles open up new avenues to improve our understanding of PD pathogenesis.

Putative gain-of-function mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), resulting in increased kinase activity and cellular toxicity, are a leading genetic cause of Parkinson's disease (PD). Hence, there is strong interest in developing LRRK2 kinase inhibitors as a disease-modifying therapy. Published reports that repeat dosing with two LRRK2 kinase inhibitors (GNE-7915 and GNE-0877) induce histopathological changes in the lung of non-human primates Fuji et al. 2015 raised concerns about potential safety liability of LRRK2 kinase inhibitors. In the present study, we sought to determine whether previously observed effects in the lung: (a) represent on-target pharmacology, but with the potential for margin of safety, (b) are reversible upon drug withdrawal, and (c) are associated with pulmonary function deficits. To this end, we evaluated the histopathological effects, toxicokinetics and target inhibition of three structurally diverse LRRK2 kinase inhibitors, GNE-7915 (30 mg/kg, BID, as a positive control), MLi-2 (15 and 50 mg/kg, QD) and PFE-360 (3 and 6 mg/kg, QD) following 2 weeks of dosing in non-human primates. Subsets of animals dosed with GNE-7915 or MLi-2 were evaluated after 2-week dose-free periods. All three LRRK2 kinase inhibitors induced mild cytoplasmic vacuolation of type II pneumocytes, as reported previously, confirming an on-target effect of these compounds. Interestingly, despite lower doses of both PFE-360 and MLi-2 producing nearly complete inhibition of LRRK2 kinase activity in the brain as assessed by levels of pS935-LRRK2, histopathological changes in lung were absent in animals treated with low-dose PFE-360 and observed only sporadically in the low-dose MLi-2 group. The lung effect was fully reversible at 2 weeks post-dosing of GNE-7915. In a second study of identical dosing with MLi-2 and GNE-7915, no deficits were observed in a battery of translational pulmonary functional tests. In aggregate, these results do not preclude the development of LRRK2 kinase inhibitors for clinical investigation in Parkinson's disease.