Individuals infected with Mycobacterium tuberculosis (Mtb) may develop symptoms and signs of disease (tuberculosis disease) or may have no clinical evidence of disease (latent tuberculosis infection [LTBI]). Tuberculosis disease is a leading cause of infectious disease morbidity and mortality worldwide, yet many questions related to its diagnosis remain.A task force supported by the American Thoracic Society, Centers for Disease Control and Prevention, and Infectious Diseases Society of America searched, selected, and synthesized relevant evidence. The evidence was then used as the basis for recommendations about the diagnosis of tuberculosis disease and LTBI in adults and children. The recommendations were formulated, written, and graded using the Grading, Recommendations, Assessment, Development and Evaluation (GRADE) approach.Twenty-three evidence-based recommendations about diagnostic testing for latent tuberculosis infection, pulmonary tuberculosis, and extrapulmonary tuberculosis are provided. Six of the recommendations are strong, whereas the remaining 17 are conditional.These guidelines are not intended to impose a standard of care. They provide the basis for rational decisions in the diagnosis of tuberculosis in the context of the existing evidence. No guidelines can take into account all of the often compelling unique individual clinical circumstances.

ABSTRACT Rifampin is a cornerstone of modern antituberculosis therapy. However, rifampin's half-life of 3 h is believed to limit its utility for intermittent therapy, so new congeners with long half-lives are being developed. Using an in vitro pharmacokinetic-pharmacodynamic model of tuberculosis, we examined the relationships between rifampin exposure, microbial killing of log-phase-growth Mycobacterium tuberculosis , and suppression of resistance. Rifampin's microbial killing was linked to the area under the concentration-time curve-to-MIC ratio. The suppression of resistance was associated with the free peak concentration ( C max )-to-MIC ratio and not the duration that the rifampin concentration was above MIC. Rifampin prevented resistance to itself at a free C max /MIC ratio of ≥175. The postantibiotic effect duration was ≥5.2 days and was most closely related to the C max /MIC ratio ( r 2 = 0.96). To explain rifampin's concentration-dependent effect, we examined the kinetics of rifampin entry into M. tuberculosis . Rifampin achieved concentration-dependent intracellular steady-state concentrations within 15 min. Our results suggest that doses of rifampin higher than those currently employed would optimize the effect of rifampin, if patients could tolerate them. Another major implication is that in the design of new rifampin congeners for intermittent therapy, the important properties may include (i) the efficient entry of the rifamycin into M. tuberculosis , (ii) the achievement of a free C max /MIC of >175 that can be tolerated by patients, and (iii) a long postantibiotic effect duration.

Abstract Background Short-read whole genome sequencing (WGS) is a vital tool for clinical applications and basic research. Genetic divergence from the reference genome, repetitive sequences, and sequencing bias, reduce the performance of variant calling using short-read alignment, but the loss in recall and specificity has not been adequately characterized. For the clonal pathogen Mycobacterium tuberculosis (Mtb), researchers frequently exclude 10.7% of the genome believed to be repetitive and prone to erroneous variant calls. To benchmark short-read variant calling, we used 36 diverse clinical Mtb isolates dually sequenced with Illumina short-reads and PacBio long-reads. We systematically study the short-read variant calling accuracy and the influence of sequence uniqueness, reference bias, and GC content. å Results Reference based Illumina variant calling had a recall ≥89.0% and precision ≥98.5% across parameters evaluated. The best balance between precision and recall was achieved by tuning the mapping quality (MQ) threshold, i.e. confidence of the read mapping (recall 85.8%, precision 99.1% at MQ ≥ 40). Masking repetitive sequence content is an alternative conservative approach to variant calling that maintains high precision (recall 70.2%, precision 99.6% at MQ≥40). Of the genomic positions typically excluded for Mtb, 68% are accurately called using Illumina WGS including 52 of the 168 PE/PPE genes (34.5%). We present a refined list of low confidence regions and examine the largest sources of variant calling error. Conclusions Our improved approach to variant calling has broad implications for the use of WGS in the study of Mtb biology, inference of transmission in public health surveillance systems, and more generally for WGS applications in other organisms.

Nontuberculous mycobacteria (NTM) pose a threat to individuals with cystic fibrosis (CF) due to an increased prevalence of pulmonary infections, innate drug resistance of the bacteria, and potential transmission between CF patients. To explore the genetic diversity of NTM isolated from CF patients within the United States (US) and to identify potential transmission events, we sequenced and analyzed the genomes of 341 NTM isolates from 191 CF patients as part of a nationwide surveillance study. The most abundant species in the isolate cohort were Mycobacterium abscessus (59.5%), followed by species in the Mycobacterium avium complex (37.5%). Phylogenomic analyses of the three M. abscessus subspecies revealed that more than half of CF patients had isolates in one of four dominant clones, including two dominant clones of M. abscessus subspecies abscessus and two dominant clones of M. abscessus subspecies massiliense. M. avium isolates from US CF patients, however, do not have dominant clones and are phylogenetically diverse. Longitudinal NTM isolates were compared to determine genome-wide single nucleotide polymorphisms (SNPs) that occur within patients over time. This information was used to compare between and within-patient SNP distributions, to quantitatively define SNP thresholds suggestive of transmission, and calculate a posterior probability of recent transmission given the SNP distance between two isolates from different patients. Out of 114 patients with M. abscessus subspecies, ten clusters of highly similar isolates from 26 patients were identified. Among the 26 patients in the M. abscessus clusters, 12 attended the same CF care centers. No highly similar isolate clusters were observed in M. avium. Our study reveals the contrasting genomic diversity and epidemiology of two major NTM taxa and the potential for between-patient exposure and cross-transmission of these emerging pathogens.

Background : Tuberculosis (TB) is a leading cause of death globally from an infectious agent. Understanding the population dynamics of TBs causative agent Mycobacterium tuberculosis (Mtb) in-host is vital for understanding the efficacy of antibiotic treatment. Here we use longitudinally collected clinical Mtb isolates that underwent Whole-Genome Sequencing (WGS) from the sputa of 307 subjects to investigate Mtb diversity during the course of active TB disease. Methods and findings : We excluded cases suspected of reinfection or contamination to analyze data from 200 subjects, 167 of which met microbiological criteria for delayed culture conversion, treatment failure or relapse. Using technical and biological replicate samples, we defined an allele frequency threshold attributable to in-host evolution. Of the 167 subjects with unsuccessful treatment outcome, 27 (16%) developed new resistance mutations between sampling with 20/27 (74%) occurring in patients with pre-existing antibiotic resistance. Low abundance resistance variants at a purity of ≥ 19% in the first isolate predicts fixation of these variants in the subsequent sample with 27.0% sensitivity and 95.8% specificity. We identify significant in-host variation in seven genes associated with antibiotic resistance and twenty other genes, including metabolic genes and genes known to modulate host innate immunity by interacting with TLR2. We confirm Rv0095c, Rv1944c, PPE18 , PPE54 and PPE60 to be under positive selection by assessing phylogenetic convergence across a global and genetically diverse independent sample of 20,352 isolates. Conclusions : Our large sample provides a comprehensive picture of the mutational dynamics in-host during active TB disease. We demonstrate a framework to study temporal changes in Mtb population diversity using average depth WGS data. We show that minor variants can be used to inform antibiotic treatment regimens in patients with TB. Furthermore, we detect a signature of positive selection in-host, possibly stemming from innate immune pressure and informing our understanding of host-pathogen interactions.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.