Every living cell releases extracellular vesicles (EVs) that are critical for cellular signaling and a wide range of biological functions. The potential diagnostic and therapeutic applications of EVs are well recognized, and rapidly expanding. While a complete understanding of the molecular mechanisms underpinning EVs release remains elusive, here we demonstrate a novel method for programmable control of the release of EVs and their cargo using external electric fields. As a proof of principle, we use cultured rat astrocytes to demonstrate how the frequency of external electrical stimulation selectively modulates EV release, their surface proteins, and microRNA profiles. This method could broadly impact biological science and medical applications. First, it raises an interesting question of how endogenous electrical activity could modulate EV production. Second, it provides a novel mechanism for tuning therapeutic electrical stimulation that may be useful for treating brain disorders. Third, it provides a new way to generate EVs carrying desired cargos by tuning electrical stimulation parameters. Unlike chemical methods for creating EVs, electrical stimulation is a clean physical method with adjustable parameters including stimulation frequency, field strength and waveform morphology.

Background: Basic scientists have used preclinical animal models to explore mechanisms driving human diseases for decades, resulting in thousands of publications, each supporting causative inferences. Despite substantial advances in the mechanistic construct of disease, there has been limited translation from individual studies to advances in clinical care. An integrated approach to these individual studies has the potential to improve translational success. Methods: Using atherosclerosis as a test case, we extracted data from the two most common mouse models of atherosclerosis (ApoE and LDLR knockout). We restricted analyses to manuscripts published in two well-established journals, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology and Circulation, as of query in 2021. Predefined variables including experimental conditions, intervention and outcomes were extracted from each publication to produce a preclinical atherosclerosis database. Results: Extracted data include animal sex, diet, intervention type and distinct plaque pathologies (size, inflammation, lipid content). Procedures are provided to standardize data extraction, attribute interventions to specific genes and transform the database for use with available transcriptomics software. The database integrates hundreds of genes, each directly tested in vivo for causation in a murine atherosclerosis model. The database is provided to allow the research community to perform integrated analyses that reflect the global impact of decades of atherosclerosis investigation. Conclusions: Future database uses include interrogation of sub-datasets associated with distinct plaque pathologies, cell-type or sex. We provide the methods and software needed to apply this approach to the extensive repository of peer-reviewed data utilizing preclinical models to interrogate mechanisms of diverse human diseases.

Extracellular vesicles (EVs) are small membrane-bound structures that originate from various cell types and carry molecular cargo to influence the behavior of recipient cells. The use of EVs as biomarkers and delivery vehicles for diagnosis and treatment in a wide range of human disease is a rapidly growing field of research and clinical practice. Four years ago, we postulated the hypothesis that electromagnetic fields (EMF) will influence the release and content of EVs (1). Since then, we have optimized several technical aspects of our experimental setup. We used a bioreactor system that allows cells to grow in a three-dimensional environment mimicking in-vivo conditions. We designed a custom-made EMF stimulation device that encompasses the bioreactor and delivers uniform EMFs. We established a three-step EV purification protocol that enables high-density production of EVs. We then performed mass spectrometry-based proteomics analysis on EV-related proteins and used high-resolution nanoparticle flowcytometry for single-vesicle analysis. We demonstrate that electrical stimulations of current amplitudes at physiological level that are currently applied in therapeutic deep brain stimulation can modulate EV content in a frequency-dependent manner, which may have important implications for basic biology and medical applications. First, it raises intriguing questions about how the endogenous electrical activity of neuronal and other cellular assemblies influence the production and composition of EVs. Second, it reveals an additional underlying mechanism of how therapeutic electrical stimulations can modulate EVs and treat human brain disorders. Third, it provides a novel approach of utilizing electrical stimulations in generating specific EV cargos.

Native cardiac ventricular myosin (βmys) translates actin under load by transducing ATP free energy into mechanical work on actin during muscle contraction. Unitary βmys translation of actin is the myosin step-size. In vitro and in vivo βmys regulates contractile force and velocity by remixing 3 different step-sizes with stepping frequencies autonomously adapted to workload. Cardiac and skeletal actin isoforms have a specific 1:4 stoichiometry in normal adult human ventriculum. Human adults with inheritable hypertrophic cardiomyopathy (HCM) up-regulate skeletal actin in ventriculum suggesting that increasing skeletal/cardiac actin stoichiometry also adapts myosin force-velocity to respond to the muscles inability to meet demand. Nanometer scale displacement of quantum dot (Qdot) labeled actin under resistive load when impelled by βmys measures single myosin force-velocity in vitro in the Qdot assay. Unitary displacement classification constraints introduced here better separates myosin based signal from background upgrading step-size spatial resolution to the sub-nanometer range. Single βmys force-velocity for skeletal vs cardiac actin substrates was compared using the Qdot assay. Two competing myosin strain-sensitive mechanisms regulate step-size choices dividing mechanical characteristics into low- and high-force regimes. The actin isoforms alter myosin strain-sensitive regulation such that onset of the high-force regime, where a short step-size is a large or major contributor, is offset to higher loads by a unique cardiac ELC N-terminus/cardiac-actin contact at Glu6/Ser358. It modifies βmys force-velocity by stabilizing the ELC N-terminus/cardiac-actin association. Uneven onset of the high-force regime for skeletal vs cardiac actin dynamically changes force-velocity characteristics as skeletal/cardiac actin fractional content increases in diseased muscle.

The cardiac myosin motor powers the beating heart by catalyzed ATPase free energy conversion to contractile work. Transgenic mouse models for heart disease express mouse α-cardiac myosin heavy chain with human essential light chain (ELC) in wild type (WT), or hypertrophic cardiomyopathy linked mutant forms, A57G or E143K. Mutants modify the ELC actin binding N-terminus or C-terminus regions. Motility and single myosin mechanical characteristics show stark contrasts between the motors related to their average force, power, and displacement while all indicate the ability to down-shift ensemble step-size with increasing load. A57G and E143K consume more ATP than control WT in the presence of actin with A57G upregulating and E143K downregulating power compared with WT. Higher ATP consumption and downregulated power in E143K implies a lower unitary force. Effects on power are consistent with an A57G that impairs the ELC N-terminus actin binding and an E143K that reduces lever-arm rigidity.

The myosin motor powers cardiac contraction and is frequently implicated in hereditary heart disease by its mutation. Principal motor function characteristics include myosin unitary step size, duty cycle, and force-velocity relationship for translating actin under load. These characteristics are sometimes measured in vitro with a motility assay detecting fluorescent labeled actin filament gliding velocity over a planar array of surface immobilized myosin. Assay miniaturization in a polydimethylsiloxane/glass (PDMS/glass) hybrid microfluidic flow channel is an essential component to a small sample volume assay applicable to costly protein samples however the PDMS substrate dramatically inhibits myosin motility. Myosin in vitro motility in a PDMS/glass hybrid microfluidic flow cell was tested under a variety of conditions to identify and mitigate the effect of PDMS on myosin. Substantial contamination by the monomeric species in polymerized PDMS flow cells is shown to be the cause of myosin motility inhibition. Normal myosin motility recovers by either extended cell aging (~20 days) to allow more complete polymerization or by direct chemical extraction of the free monomers from the polymer substrate. PDMS flow cell aging is the low cost alternative compatible with the other PDMS and glass modifications needed for in vitro myosin motility assaying.

ABSTRACT BACKGROUND Paediatric neuroblastoma and brain tumours account for a third of all childhood cancer-related mortality. High-risk neuroblastoma is highly aggressive and survival is poor despite intensive multi-modal therapies with significant toxicity. Novel therapies are desperately needed. The Zika virus (ZIKV) is neurotropic and there is growing interest in employing ZIKV as a potential therapy against paediatric nervous system tumours, including neuroblastoma. METHODS Here, we perform an extensive meta-analysis of ZIKV infection studies to identify molecular mechanisms that may govern the oncolytic response in neuroblastoma cells. We summarise the neuroblastoma cell lines and ZIKV strains utilised and re-evaluate the infection data to deduce the susceptibility of neuroblastoma to the ZIKV oncolytic response. Integrating transcriptomics, interaction proteomics, dependency factor and compound datasets we show the involvement of multiple host systems during ZIKV infection. RESULTS We identify that most paediatric neuroblastoma cell lines are highly susceptible to ZIKV infection and that the PRVABC59 ZIKV strain is the most promising candidate for neuroblastoma oncolytic virotherapy. ZIKV induces TNF signalling, lipid metabolism, the Unfolded Protein Response (UPR), and downregulates cell cycle and DNA replication processes. ZIKV is dependent on SREBP-regulated lipid metabolism and three protein complexes; V-ATPase, ER Membrane Protein Complex (EMC) and mammalian translocon. We propose ZIKV nonstructural protein 4B (NS4B) as a likely mediator of ZIKVs interaction with IRE1-mediated UPR, lipid metabolism and mammalian translocon. CONCLUSIONS Our work provides a significant understanding of ZIKV infection in neuroblastoma cells, which will facilitate the progression of ZIKV-based oncolytic virotherapy through pre-clinical research and clinical trials. KEYPOINTS The Zika virus may provide the basis for an oncolytic virotherapy against Neuroblastoma Most paediatric neuroblastoma cell lines are susceptible to Zika viral infection We identified molecular mechanisms that may induce the oncolytic response in Neuroblastoma Contribution to the field The ability to both induce direct oncolysis and provoke an anti-tumoral immune response makes oncolytic virotherapy an attractive candidate to combat aggressive and heterogenous cancers, such as high-risk neuroblastoma. To progress oncolytic virotherapy to clinical trial it is essential to understand the host mechanisms the virus manipulates to kill cancer cells, alongside any pathology as a consequence of infection of normal cells. Here, we show that ZIKV efficiently infects and induces oncolysis of paediatric neuroblastoma cells and propose a potential TNF pathway-driven immune response. ZIKV’s specificity for infection of nervous system cancer cells, while rarely causing nervous system-related pathology in young children, addresses many of its safety concerns. The inclusion of more effective and less toxic novel therapies, such as a potential ZIKV-based therapeutic, in multimodal treatment regimens will pave the way for improving patient long-term health and overall survival.

Background: DNA methyltransferase I is the primary eukaryotic DNA methyltransferase engaged in maintenance of CpG DNA methylation patterns across the genome. Alteration of CpG methylation patterns and levels is a frequent and significant occurrence across many cancers, and targeted inhibition of Dnmt1 has become an approach of choice for select malignancies. There has been significant interest both in the methyltransferase activity as well as methylation-independent functions of Dnmt1. A previously generated hypomorphic allele of Dnmt1 in HCT116 colorectal cancer cells has become an important tool for understanding Dnmt1 function and how CpG methylation patterns are modulated across the genome. Colorectal cancer cells with the Dnmt1 hypomorphic allele carry a homozygous deletion of exons 3 to 5 of Dnmt1, resulting in greatly reduced Dnmt1 protein expression whilst still exhibiting a limited functional activity and methyltransferase ability. Although this cell model of reduced Dnmt1 levels and function have been used to study the downstream effects on the epigenome and transcriptome, the broader effects of the Dnmt1 hypomorph on the proteome and wider cell signalling are largely unknown. Results: In this study, we used quantitative proteomic analysis of nuclear-enriched samples of HCT116 Dnmt1 hypomorph cells to identify signalling pathways and processes dysregulated in the hypomorph cells as compared to wild-type HCT116 cells. Unexpectedly, we observed a clear signature of increased expression of Epithelial-to-Mesenchymal (EMT) in Dnmt1 hypomorph cells. We also observed reduced expression and sub-cellular re-localization of Beta-Catenin in Dnmt1 hypomorph cells. Expression of wild-type Dnmt1 in hypomorph cells or knock-down of wild-type Dnmt1 did not recapitulate or rescue the observed protein profiles in Dnmt1 hypomorph cells suggesting that hypomorphic Dnmt1 causes changes not solely attributable to Dnmt1 protein levels. Conclusions: In summary we present the first comprehensive proteomic analysis of the widely studied Dnmt1 hypomorph colorectal cancer cells and identify redistribution of Dnmt1 and its interaction partner Beta-Catenin as well as the dysregulation of EMT related processes and signalling pathways related to the development of a cancer stem cell phenotype.

Abstract Extracellular matrix (ECM) stiffening with downstream activation of mechanosensitive pathways is strongly implicated in fibrosis. We previously reported that altered collagen nanoarchitecture is a key determinant of pathogenetic ECM structure-function in human fibrosis (Jones et al., 2018). Here, through human tissue, bioinformatic and ex vivo studies we show that hypoxia-inducible factor (HIF) pathway activation is a critical pathway for this process regardless of oxygen status (pseudohypoxia). Whilst TGFβ increased rate of fibrillar collagen synthesis, HIF pathway activation was required to dysregulate post-translational modification of fibrillar collagen, promoting ‘bone-type’ cross-linking, altering collagen nanostructure, and increasing tissue stiffness. In vitro , knock down of Factor Inhibiting HIF (FIH) or oxidative stress caused pseudohypoxic HIF activation in normal fibroblasts. In contrast, endogenous FIH activity was reduced in fibroblasts from patients with lung fibrosis in association with significantly increased normoxic HIF pathway activation. In human lung fibrosis tissue, HIF mediated signalling was increased at sites of active fibrogenesis whilst subpopulations of IPF lung mesenchymal cells had increases in both HIF and oxidative stress scores. Our data demonstrate that oxidative stress can drive pseudohypoxic HIF pathway activation which is a critical regulator of pathogenetic collagen structure-function in fibrosis.