Abstract Adenoviruses (AdVs) are prevalent and give rise to chronic and recurrent disease. The human AdV (HAdV) species B and C, such as HAdV-C2, C5 and B14, cause respiratory disease, and constitute a health threat for immuno-compromised individuals. HAdV-Cs are well known for lysing cells, owing to the E3 CR1-β-encoded adenovirus death protein (ADP). We previously reported a high-throughput image-based screening framework and identified an inhibitor of HAdV-C2 multi-round infection, Nelfinavir Mesylate. Nelfinavir is the active ingredient of Viracept, an FDA-approved inhibitor of the human immuno-deficiency virus (HIV) aspartyl protease, and used to treat acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). It is not effective against single round HAdV infections. Here, we show that Nelfinavir inhibits the lytic cell-free transmission of HAdV, indicated by the suppression of comet-shaped infection foci in cell culture. Comet-shaped foci occur upon convection-based transmission of cell-free viral particles from an infected cell to neighbouring uninfected cells. HAdV lacking ADP was insensitive to Nelfinavir, but gave rise to comet-shaped foci indicating that ADP enhances but is not required for cell lysis. This was supported by the notion that HAdV-B14 and B14p1 lacking ADP were highly sensitive to Nelfinavir, although HAdV-A31, B3, B7, B11, B16, B21, D8, D30 or D37 were less sensitive. Conspicuously, Nelfinavir uncovered slow-growing round-shaped HAdV-C2 foci, independent of neutralizing antibodies in the medium, indicative of non-lytic cell-to-cell transmission. Our study demonstrates the repurposing potential of Nelfinavir with post-exposure efficacy against different HAdVs, and describes an alternative non-lytic cell-to-cell transmission mode of HAdV. Graphical Abstract Figure 1.

Abstract The cell entry mechanism of SARS-CoV-2, the causative agent of the COVID-19 pandemic, is not fully understood. Most animal viruses hijack cellular endocytic pathways as an entry route into the cell. Here, we show that in cells that do not express serine proteases such as TMPRSS2, genetic depletion of all dynamin isoforms blocked the uptake and strongly reduced infection with SARS-CoV-2 and its variant Delta. However, increasing the viral loads partially and dose-dependently restored infection via a thus far uncharacterized entry mechanism. Ultrastructural analysis by electron microscopy showed that this dynamin-independent endocytic processes appeared as 150-200 nm non-coated invaginations and was efficiently used by numerous mammalian viruses, including alphaviruses, influenza, vesicular stomatitis, bunya, adeno, vaccinia, and rhinovirus. Both the dynamin-dependent and dynamin-independent infection of SARS-CoV-2 required a functional actin cytoskeleton. In contrast, the alphavirus Semliki Forest virus, which is smaller in diameter, required actin only for the dynamin-independent entry. The presence of TMPRSS2 protease rescued SARS-CoV-2 infection in the absence of dynamins. Collectively, these results indicate that some viruses such as canine parvovirus and SARS-CoV-2 mainly rely on dynamin for endocytosis-dependent infection, while other viruses can efficiently bypass this requirement harnessing an alternative infection entry route dependent on actin.

Cytopathic effects (CPEs) are a hallmark of infections. CPEs can be observed by phase contrast or fluorescence light microscopy, albeit at the cost of phototoxicity. We report that digital holographic microscopy (DHM) reveals distinct patterns of virus infections in live cells with minimal perturbation. DHM is label-free, and records the phase shift of low energy light passing through the specimen on a transparent surface. DHM infers a 3-dimensional (3D) tomogram based on the refractive index (RI). By measuring RI and computing the refractive index gradient (RIG) values DHM unveils on optical heterogeneity in cells upon virus infection. We find that vaccinia virus (VACV), herpes simplex virus (HSV) and rhinovirus (RV) infections progressively and distinctly increased RIG. VACV, but not HSV and RV infection induced oscillations of cell volume, while all three viruses altered cytoplasmic membrane dynamics, and induced apoptotic features akin to the chemical compound staurosporin, but with virus-specific signatures. In sum, we introduce DHM for quantitative label-free microscopy in infection research, and uncover virus-type specific changes and CPE in living cells at minimal interference.

Imaging across scales gives insight into disease mechanisms in organisms, tissues and cells. Yet, rare infection phenotypes, such as virus-induced cell lysis have remained difficult to study. Here, we developed fixed and live cell imaging modalities and a deep learning approach to identify herpesvirus and adenovirus infections in the absence of virus-specific stainings. Procedures comprises staining of infected nuclei with DNA-dyes, fluorescence microscopy, and validation by virus-specific live-cell imaging. Deep learning of multi-round infection phenotypes identified hallmarks of adenovirus-infected cell nuclei. At an accuracy of >95%, the procedure predicts two distinct infection outcomes 20 hours prior to lysis, nonlytic (nonspreading) and lytic (spreading) infections. Phenotypic prediction and live-cell imaging revealed a faster enrichment of GFP-tagged virion proteins in lytic compared to nonlytic infected nuclei, and distinct mechanics of lytic and nonlytic nuclei upon laser-induced ruptures. The results unleash the power of deep learning based prediction in unraveling rare infection phenotypes.

Abstract Human adenoviruses (HAdVs) are fatal to immuno-suppressed people, but no effective anti-HAdV therapy is available. Here, we present a novel image-based high-throughput screening (HTS) platform, which scores the full viral replication cycle from virus entry to dissemination of progeny. We analysed 1,280 small molecular weight compounds of the Prestwick Chemical Library (PCL) for interference with HAdV-C2 infection in a quadruplicate, blinded format, and included robust image analyses, and hit filtering. We present the entire set of the screening data including all the images, image analyses and data processing pipelines. The data are made available at the Image Data Repository (IDR) 1 , accession number idr0081. Our screen identified Nelfinavir mesylate as an inhibitor of HAdV-C2 multi-round plaque formation, but not single round infection. Nelfinavir has been FDA-approved for anti-retroviral therapy in humans. Our results underscore the power of image-based full cycle infection assays in identifying viral inhibitors with clinical potential.