Abstract Neutralizing antibodies (Abs) have been considered as promising therapeutics for the prevention and treatment of pathogens. After the outbreak of COVID-19, potent neutralizing Abs to SARS-CoV-2 were promptly developed, and a few of those neutralizing Abs are being tested in clinical studies. However, there were few methodologies detailly reported on how to rapidly and efficiently generate neutralizing Abs of interest. Here, we present a strategically optimized method for precisive screening of neutralizing monoclonal antibodies (mAbs), which enabled us to identify SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) specific Abs within 4 days, followed by another 2 days for neutralization activity evaluation. By applying the screening system, we obtained 198 Abs against the RBD of SARS-CoV-2. Excitingly, we found that approximately 50% (96/198) of them were candidate neutralizing Abs in a preliminary screening of SARS-CoV-2 pseudovirus and 20 of these 96 neutralizing Abs were confirmed with high potency. Furthermore, 2 mAbs with the highest neutralizing potency were identified to block authentic SARS-CoV-2 with the half-maximal inhibitory concentration (IC50) at concentrations of 9.88 ng/ml and 11.13 ng/ml. In this report, we demonstrated that the optimized neutralizing Abs screening system is useful for the rapid and efficient discovery of potent neutralizing Abs against SARS-CoV-2. Our study provides a methodology for the generation of preventive and therapeutic antibody drugs for emerging infectious diseases.

ABSTRACT Despite the growing knowledge of T cell responses and their epitopes in COVID-19 patients, there is a lack of detailed characterizations for T cell-antigen interactions and T cell functions. Using a peptide library predicted with HLA class I-restriction, specific CD8 + T cell responses were identified in over 75% of COVID-19 convalescent patients. Among the 15 SARS-CoV-2 epitopes identified from the S and N proteins, N 361-369 (KTFPPTEPK) was the most dominant epitope. Importantly, we discovered 2 N 361-369 -specific T cell receptors (TCRs) with high functional avidity, and they exhibited complementary cross-reactivity to reported N 361-369 mutant variants. In dendritic cells (DCs) and the lung organoid model, we found that the N 361-369 epitope could be processed and endogenously presented to elicit the activation and cytotoxicity of CD8 + T cells ex vivo . Our study evidenced potential mechanisms of cellular immunity to SARS-CoV-2, illuminating natural ways of viral clearance with high relevancy in the vaccine development.

Abstract The spread of SARS-CoV-2 confers a serious threat to the public health without effective intervention strategies 1–3 . Its variant carrying mutated Spike (S) protein D614G (S D614G ) has become the most prevalent form in the current global pandemic 4,5 . We have identified a large panel of potential neutralizing antibodies (NAbs) targeting the receptor-binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 S 6 . Here, we focused on the top 20 potential NAbs for the mechanism study. Of them, the top 4 NAbs could individually neutralize both authentic SARS-CoV-2 and S D614G pseudovirus efficiently. Our epitope mapping revealed that 16/20 potent NAbs overlapped the same steric epitope. Excitingly, we found that one of these potent NAbs (58G6) exclusively bound to a linear epitope on S-RBD (termed as 58G6e), and the interaction of 58G6e and the recombinant ACE2 could be blocked by 58G6. We confirmed that 58G6e represented a key site of vulnerability on S-RBD and it could positively react with COVID-19 convalescent patients’ plasma. We are the first, as far as we know, to provide direct evidences of a linear epitope that can be recognized by a potent NAb against SARS-CoV-2 S-RBD. This study paves the way for the applications of these NAbs and the potential safe and effective vaccine design.

Abstract Accumulating mutations in the SARS-CoV-2 Spike (S) protein can increase the possibility of immune escape, challenging the present COVID-19 prophylaxis and clinical interventions. Here, 3 receptor binding domain (RBD) specific monoclonal antibodies (mAbs), 58G6, 510A5 and 13G9, with high neutralizing potency blocking authentic SARS-CoV-2 virus displayed remarkable efficacy against authentic B.1.351 virus. Each of these 3 mAbs in combination with one neutralizing Ab recognizing non-competing epitope exhibited synergistic effect against authentic SARS-CoV-2 virus. Surprisingly, structural analysis revealed that 58G6 and 13G9, encoded by the IGHV1-58 and the IGKV3-20 germline genes, both recognized the steric region S 470-495 on the RBD, overlapping the E484K mutation presented in B.1.351. Also, 58G6 directly bound to another region S 450-458 in the RBD. Significantly, 58G6 and 510A5 both demonstrated prophylactic efficacy against authentic SARS-CoV-2 and B.1.351 viruses in the transgenic mice expressing human ACE2 (hACE2), protecting weight loss and reducing virus loads. These 2 ultrapotent neutralizing Abs can be promising candidates to fulfill the urgent needs for the prolonged COVID-19 pandemic.

ABSTRACT Rationale Mitochondrial fission and fusion are relatively infrequent in adult cardiomyocytes compared to another cell types 1–3 . This is surprising considering that proteins involved in mitochondrial dynamics are highly expressed in the heart. It has been previously reported that dynamin-related protein 1 (DRP1) has a critical role in mitochondrial fitness and cardiac protection 1, 4 . Cardiac DRP1 ablation in the adult heart evokes a progressive dilated cardiac myopathy and lethal heart failure 1 . Nevertheless, the conditional cardiac-specific DRP1 knock-out animals present a significantly longer survival rate compared with global DRP1 KO models 1, 4, 5 . We have described before the great importance for cardiac physiology of the strategic positioning of mitochondrial proteins in the cardiac tissue 6, 7 . Therefore, we hypothesize that DRP1 plays a regulatory role in cardiac physiology and mitochondrial fitness by preferentially accumulating at mitochondria and junctional sarcoplasmic reticulum (jSR) contact sites, where the high Ca 2+ microdomain is formed during excitation-contraction (EC) coupling. Objective This study aims to determine whether mitochondria-associated DRP1 is preferentially accumulated in the mitochondria and jSR contact sites, the mechanism responsible for such a biased distribution, and its functional implication. Methods and Results Using high-resolution imaging approaches, we found that mitochondria-associated DRP1 in cardiomyocytes was localized in the discrete regions where T-tubule, jSR, and mitochondria are adjacent to each other. Western blot results showed that mitochondria-bound DRP1 was restricted to the mitochondria-associated membranes (MAM), with undetectable levels in purified mitochondria. Furthermore, in comparison to the cytosolic DRP1, the membrane-bound DRP1 in SR and MAM fractions formed high molecular weight oligomers demosntratd by 2D blue native technique. In both electrically paced adult cardiomyocytes and Langendorff-perfused beating hearts, the oscillatory Ca 2+ pulses preserved MAM-associated DRP1 accumulation. Interestingly, similar to DRP1, all mitochondria-bound β-ACTIN only exists in MAM and not in the purified mitochondria. Additionally, co-immunoprecipitation pulls down both DRP1 and β-ACTIN together. Inhibition of β-ACTIN polymerization with Cytochalasin D disrupts the tight association between DRP1 and β-ACTIN. In cardiac-specific DRP1 knock-out mouse after 6 weeks of tamoxifen induction (DRP1icKo), the cardiomyocytes show disarray of sarcomere, a decrease of cardiac contraction, loss of mitochondrial membrane potential, significantly decreased spare respiratory capacity, and frequent occurrence of early after contraction (EAC), suggesting the heart is susceptible to arrhythmias and heart failure. Despite of this phenotype, DRP1icKo animals have longer life span than other DRP1 KO models. Strikingly, DRP1 levels are only modestly decreased in the MAM when compared with the rest of the cellular fractions. These preserved levels were accompanied by the preservation of the mitochondrial pool in the MAM fraction obtained from the DRP1icKO hearts. Conclusions The results show that in adult cardiomyocytes, mitochondria bound DRP1 clusters in high molecular weight protein complexes at MAM. This clustering is fortified by EC coupling mediated Ca 2+ transients and requires its interaction with β-ACTIN. Together with the better preserved DRP1 levels in the DRP1icKO model in the MAM, we conclude that DRP1 is anchored at the mitochondria-SR interface through β-ACTIN and positions itself to play a fundamental role in regulating mitochondrial quality control in the working heart.

Aging-associated diseases, including cardiac dysfunction, are increasingly common in the population. However, the mechanisms of physiologic aging in general, and cardiac aging in particular, remain poorly understood. While effective medical interventions are available for some kinds of heart failure, one age-related impairment, diastolic dysfunction in Heart Failure with Preserved Ejection Fraction (HFpEF) is lacking a clinically effective treatment. Using the model of naturally aging mice and rats, we show direct evidence of increased proton leak in the aged heart mitochondria. Moreover, we identified ANT1 as mediating the increased proton permeability of old cardiomyocytes. Most importantly, the tetra-peptide drug SS-31 (elamipretide) prevents age-related excess proton entry, decreases the mitochondrial flash activity and mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening and rejuvenates mitochondrial function by direct association with ANT1 and the mitochondrial ATP synthasome. Our results uncover a novel mechanism of age-related cardiac dysfunction and elucidate how SS-31 is able to reverse this clinically important complication of cardiac aging.

Abstract Hypoxic adaptation mediated by HIF transcription factors has been shown to require mitochondria. Current models suggest that mitochondria regulate oxygen sensor (HIF prolyl hydroxylase) activity and HIF1α stability during hypoxia by either increasing mitochondrial peroxide as a second messenger or by serving as oxygen consumers that enhance the kinetics of cytoplasmic oxygen reduction. Here, we address the role of mitochondrial peroxide specifically in regulating HIF1α stability. We use state-of-the-art tools to evaluate the role of peroxide and other reactive oxygen species (ROS) in regulating HIF1α stability. We show that antioxidant enzymes are not homeostatically induced nor are peroxide levels increased in hypoxia. Forced expression of diverse antioxidant enzymes, all of which diminish peroxide, had disparate effects on HIF1α protein stability. Reduction of lipid peroxides by glutathione peroxidase-4 or superoxide by mitochondrial SOD failed to influence HIF1α protein stability. These data showed that mitochondrial, cytosolic and lipid ROS are dispensable for HIF1α stability and should affirm therapeutic efforts to activate the HIF pathway in disease states by HIF prolyl hydroxylase inhibition.