Control of cell proliferation is a fundamental aspect of tissue physiology central to morphogenesis, wound healing, and cancer. Although many of the molecular genetic factors are now known, the system level regulation of growth is still poorly understood. A simple form of inhibition of cell proliferation is encountered in vitro in normally differentiating epithelial cell cultures and is known as “contact inhibition.” The study presented here provides a quantitative characterization of contact inhibition dynamics on tissue-wide and single cell levels. Using long-term tracking of cultured Madin-Darby canine kidney cells we demonstrate that inhibition of cell division in a confluent monolayer follows inhibition of cell motility and sets in when mechanical constraint on local expansion causes divisions to reduce cell area. We quantify cell motility and cell cycle statistics in the low density confluent regime and their change across the transition to epithelial morphology which occurs with increasing cell density. We then study the dynamics of cell area distribution arising through reductive division, determine the average mitotic rate as a function of cell size, and demonstrate that complete arrest of mitosis occurs when cell area falls below a critical value. We also present a simple computational model of growth mechanics which captures all aspects of the observed behavior. Our measurements and analysis show that contact inhibition is a consequence of mechanical interaction and constraint rather than interfacial contact alone, and define quantitative phenotypes that can guide future studies of molecular mechanisms underlying contact inhibition.

Abstract Cells must coordinate their metabolism and fate trajectories ( 1, 2 ), but the underlying mechanisms are only beginning to be discovered. To understand why the glycolytic enzyme enolase 1 (ENO1) binds RNA ( 3–6 ), we studied this phenomenon in vitro, in human cells, and during mouse embryonic stem cell differentiation. We find specific cellular RNA ligands that inhibit ENO1’s enzymatic activity in vitro. Increasing the concentration of these ligands in cultured cells inhibits glycolysis. We demonstrate that pluripotent stem cells expressing an ENO1 mutant that is hyper-inhibited by RNA are severely impaired in their glycolytic capacity and in endodermal differentiation, whereas cells with an RNA binding-deficient ENO1 mutant display disproportionately high endodermal marker expression. Our findings uncover ENO1 riboregulation as a novel form of metabolic control. They also describe an unprecedented mechanism involved in the regulation of stem cell differentiation. One Sentence Summary RNA directly regulates enzyme activity to control metabolism and stem cell fate

Abstract During development, different tissues acquire distinct lipotypes that are coupled to tissue function and homeostasis. In the brain, where complex membrane trafficking systems are required for neural function, specific glycerophospholipids, sphingolipids, and cholesterol are highly abundant, and defective lipid metabolism is associated with abnormal neural development and neurodegenerative disease. Notably, the production of tissue-specific lipotypes requires appropriate programming of the underlying lipid metabolic machinery, but when and how this occurs is unclear. To address this, we used high-resolution mass spectrometry-based (MS ALL ) lipidomics to perform a quantitative and comprehensive analysis of mouse brain development covering early embryonic and postnatal stages. We discovered a distinct bifurcation in the establishment of the neural lipotype, whereby the canonical brain lipid biomarkers 22:6-glycerophospholipids and 18:0-sphingolipids begin to be produced in utero , whereas cholesterol attains its characteristic high levels after birth. In contrast, when profiling rodent and human stem cell-derived neurons, we observed that these do not acquire a brain lipotype per se . However, upon probing the lipid metabolic wiring by supplementing brain lipid precursors, we found that the stem cell-derived neurons were partially able to establish a brain-like lipotype, demonstrating that the cells are partially metabolically committed. Altogether, our report provides an extensive lipidomic resource for brain development and highlights a potential challenge in using stem cell-derived neurons for mechanistic studies of lipid biochemistry, membrane biology and biophysics that can be mitigated by further optimizing in vitro differentiation protocols. Significance Statement We report an extensive time-resolved resource of lipid molecule abundances across mouse brain development, starting as early as 10 days post-fertilization. The resource reveals a bifurcation in the establishment of the neural lipotype where the canonical 22:6-glycerophospholipid and 18:0-sphingolipid biomarkers are attained in utero , whereas cholesterol is attained after birth. Furthermore, we uncover that the neural lipotype is not established in rodent and human stem cell-derived neurons in vitro .

Cell differentiation typically occurs with concomitant shape transitions to enable specialized functions. To adopt a different shape, cells need to change the mechanical properties of their surface. However, whether conversely cell surface mechanics control the process of differentiation has been relatively unexplored. Here, we show that membrane mechanics gate the exit from naïve pluripotency of mouse embryonic stem cells. By measuring membrane tension during differentiation, we find that naïve stem cells release their plasma membrane from the underlying actin cortex when transitioning to a primed state. By mechanically tethering the plasma membrane to the cortex with a synthetic signalling-inert linker, we demonstrate that preventing this detachment forces stem cells to retain their naïve pluripotent state. We thus identify a decrease in membrane-to-cortex attachment as a new cell-intrinsic mechanism that is essential for stem cells to exit pluripotency.

Spatio-temporal regulation of signalling pathways plays a key role in generating diverse responses during the development of multicellular organisms. The role of signal dynamics in transferring signalling information in vivo is incompletely understood. Here we employ genome engineering in Drosophila melanogaster to generate a functional optogenetic allele of the Notch ligand Delta (opto-Delta), which replaces both copies of the endogenous wild type locus. Using clonal analysis, we show that optogenetic activation blocks Notch activation through cis-inhibition in signal-receiving cells. Signal perturbation in combination with quantitative analysis of a live transcriptional reporter of Notch pathway activity reveals differential tissue- and cell-scale regulatory modes. While at the tissue-level the duration of Notch signalling determines the probability with which a cellular response will occur, in individual cells Notch activation acts through a switch-like mechanism. Thus, time confers regulatory properties to Notch signalling that exhibit integrative digital behaviours during tissue differentiation.

Abstract The majority of mammalian genes are under regulation by microRNAs, yet predicting the extent of miRNA-mediated repression has remained elusive. Here we systematically quantified the biological impact of miRNAs conserved in vertebrates using stable mouse embryonic stem cell lines expressing sensitive fluorescent reporters. Differentiation of these 163 lines to the three germ layers revealed that the majority of conserved miRNAs have detectable changes in activity. We determined in vivo target affinity K D of 115 miRNAs by integrating activity measurements, CRISPR/Cas miRNA knockouts and miRNA sequencing. Target affinities of individual miRNAs spanned several orders of magnitude, with highly expressed miRNAs having overall higher K D . Scaling miRNA expression levels by their respective K D recapitulated the relative number of Argonaute-bound targets for individual miRNA families. Our results provide a rationale to determine the set of miRNAs with a biological activity in a given cell type, K D values setting expression thresholds for target repression.

SUMMARY The formation of the primitive streak (PS) and the subsequent induction of neuroectoderm are hallmarks of gastrulation. Combining an in vitro reconstitution of this process based on mouse embryonic stem cells (mESCs) with a collection of knockouts in reporter mESC lines, we reassessed the contribution of retinoic acid (RA) signaling at early stages of neural commitment and its cross-talk with TGF β and Wnt signaling inhibition. Single-cell RNA sequencing analysis captured the temporal unfolding of cell type diversification from epiblast and primitive streak-like cells up to the emergence of anterior and posterior neural fates. In conditions thought to lack RA synthesis, we discovered a hitherto unidentified residual RA production via a sensitive RA reporter. Genetic perturbations proved that the RA-degrading enzyme Cyp26a1 safeguard the developmental capabilities of the PS-like cells, limiting neural differentiation in wild type and in Chrd -/- Nog -/- or Dkk1 -/- cells. Finally, the knockout of the three RAR receptors highlighted their function as negative regulators of loci critical for neural induction. Overall, we identified two mechanisms whereby components of the RA pathway can control the formation of neural progenitors in our PS-like context: a RA-dependent neural induction gated by RARs, and a receptor-mediated repression in the absence of ligand.