ABSTRACT During infection, plant pathogenic fungi secrete a set of molecules collectively known as effectors, involved in overcoming the host immune system and in disease establishment. Effector genes are concertedly expressed as waves all along plant pathogenic fungi lifecycle. However, little is known about how coordinated expression of effector genes is regulated. Since many effector genes are located in repeat-rich regions, the role of chromatin remodeling in the regulation of effector expression was recently investigated. In Leptosphaeria maculans , causing stem canker of oilseed rape, we established that the repressive histone modification H3K9me3 (trimethylation of Lysine 9 of Histone H3), deposited by the histone methyltransferase KMT1, was involved in the regulation of expression of genes highly expressed during infection, including effectors. Nevertheless, inactivation of KMT1 did not induce expression of these genes at the same level as observed during infection of oilseed rape, suggesting that a second regulator, such as a transcription factor (TF), might be involved. Pf2, a TF belonging to the Zn2Cys6 fungal specific TF family, was described in several Dothideomycete species as essential for pathogenicity and effector gene expression. We identified the orthologue of Pf2 in L. maculans , LmPf2, and investigated the role of LmPf2 together with KMT1, by inactivating and over-expressing LmPf2 in a wild type (WT) strain and a Δkmt1 mutant. Functional analyses of the corresponding transformants highlighted an essential role of LmPf2 in the establishment of pathogenesis. Transcriptomic analyses during axenic growth showed that LmPf2 is involved in the control of effector gene expression. We observed an enhanced effect of the over-expression of LmPf2 on effector gene expression in a Δkmt1 background, suggesting an antagonist role between KMT1 and LmPf2.

Abstract With only a few exceptions, fungal effectors (small secreted proteins) have long been considered as species- or even isolate-specific. With the increasing availability of high-quality fungal genomes and annotations, trans-species or trans-genera families of effectors are being uncovered. Two avirulence effectors, AvrLm10A and AvrLm10B , of Leptosphaeria maculans , the fungus responsible for stem canker of oilseed rape, are members of such a large family of effectors. AvrLm10A and AvrLm10B are neighboring genes, organized in divergent transcriptional orientation. Sequence searches within the L. maculans genome show that AvrLm10A / AvrLm10B belong to a multigene family comprising five pairs of genes with a similar tail-to-tail organization. The two genes in a pair always had the same expression pattern and two expression profiles were distinguished, associated with the biotrophic colonization of cotyledons and / or petioles and stems. Of the two protein pairs further investigated Lmb_jn3_08094/Lmb_jn3_08095 and Lmb_jn3_09745 / Lmb_jn3_09746, one (Lmb_jn3_09745 / Lmb_jn3_09746) had the ability to physically interact, similarly to what was previously described for the AvrLm10A/AvrLm10B pair. AvrLm10A homologues are present in more than 30 Dothideomycete and Sordariomycete plant-pathogenic fungi whereas fewer AvrLm10B homologues were identified. One of the AvrLm10A homologues, SIX5, is an effector from Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici physically interacting with the avirulence effector Avr2. We found that AvrLm10A homologues were associated with at least eight distinct putative effector families, suggesting an ability of AvrLm10A/SIX5 to cooperate with diverse effectors. These results point to a general role of the AvrLm10A/SIX5 protein as a ‘cooperator protein’, able to interact with diverse families of effectors whose encoding gene is co-regulated with the neighboring AvrLm10A homologue.

Abstract Recognition of a pathogen avirulence (AVR) effector protein by a cognate plant resistance (R) protein triggers a set of immune responses that render the plant resistant. Pathogens can escape this so-called Effector-Triggered Immunity (ETI) by different mechanisms including the deletion or loss-of-function mutation of the AVR gene, the incorporation of point mutations that allow recognition to be evaded while maintaining virulence function, and the acquisition of new effectors that suppress AVR recognition. The Dothideomycete Leptosphaeria maculans , causal agent of oilseed rape stem canker, is one of the few fungal pathogens where suppression of ETI by an AVR effector has been demonstrated. Indeed, AvrLm4-7 suppresses Rlm3- and Rlm9- mediated resistance triggered by AvrLm3 and AvrLm5-9, respectively. The presence of AvrLm4-7 does not impede AvrLm3 and AvrLm5-9 expression, and the three AVR proteins do not appear to physically interact. To decipher the epistatic interaction between these L. maculans AVR effectors, we determined the crystal structure of AvrLm5-9 and obtained a 3D model of AvrLm3, based on the crystal structure of Ecp11-1, a homologous AVR effector candidate from Fulvia fulva . Despite a lack of sequence similarity, AvrLm5-9 and AvrLm3 are structural analogues of AvrLm4-7 (structure previously characterized). Structure-informed sequence database searches identified a larger number of putative structural analogues among L. maculans effector candidates, including the AVR effector AvrLmS-Lep2, all produced during the early stages of oilseed rape infection, as well as among effector candidates from other phytopathogenic fungi. These structural analogues are named LARS (for Leptosphaeria AviRulence and Suppressing) effectors. Remarkably, transformants of L. maculans expressing one of these structural analogues, Ecp11-1, triggered oilseed rape immunity in several genotypes carrying Rlm3 . Furthermore, this resistance could be suppressed by AvrLm4-7. These results suggest that Ecp11-1 shares a common activity with AvrLm3 within the host plant which is detected by Rlm3, or that the Ecp11-1 structure is sufficiently close to that of AvrLm3 to be recognized by Rlm3. Author summary An efficient strategy to control fungal diseases in the field is genetic control using resistant crop cultivars. Crop resistance mainly relies on gene-for-gene relationships between plant resistance ( R ) genes and pathogen avirulence ( AVR ) genes, as defined by Flor in the 1940s. However, such gene-for-gene relationships can increase in complexity over the course of plant-pathogen co-evolution. Resistance against the plant-pathogenic fungus Leptosphaeria maculans by Brassica napus and other Brassica species relies on the recognition of effector (AVR) proteins by R proteins; however, L. maculans produces an effector that suppresses a subset of these specific resistances. Using a protein structure approach, we revealed structural analogy between several of the resistance-triggering effectors, the resistance-suppressing effector, and effectors from other plant-pathogenic species in the Dothideomycetes and Sordariomycetes classes, defining a new family of effectors called LARS. Notably, cross-species expression of one LARS effector from Fulvia fulva , a pathogen of tomato, in L. maculans resulted in recognition by several resistant cultivars of oilseed rape. These results highlight the need to integrate knowledge on effector structures to improve resistance management and to develop broad-spectrum resistances for multi-pathogen control of diseases.