ABSTRACT Expansins facilitate cell expansion via mediating pH-dependent cell wall (CW) loosening. However, the role of expansins in the control of biomechanical CW properties in the tissue and organ context remains elusive. We determined hormonal responsiveness and specificity of expression and localization of expansins predicted to be direct targets of cytokinin signalling. We found EXPA1 homogenously distributed throughout the CW of columella/ lateral root cap, while EXPA10 and EXPA14 localized predominantly at the three-cell boundaries of epidermis/cortex in various root zones. Cell type-specific localization of EXPA15 overlaps with higher CW stiffness measured via Brillouin light scattering microscopy. As indicated by both Brillouin frequency shift and AFM-measured Young’s modulus, EXPA1 overexpression upregulated CW stiffness, associated with shortening of the root apical meristem and root growth arrest. We propose that root growth in Arabidopsis requires delicate orchestration of biomechanical CW properties via tight regulation of various expansins’ localization to specific cell types and extracellular domains.

Abstract Muscle degeneration is the most prevalent cause for frailty and dependency in inherited diseases and ageing, affecting hundreds of millions of people. Elucidation of pathophysiological mechanisms, as well as effective treatments for muscle diseases represents an important goal in improving human health. Here, we show that phosphatidylethanolamine cytidyltransferase (PCYT2/ECT), the critical enzyme of the Kennedy branch of phosphatidylethanolamine (PE) synthesis pathway, has an essential role in muscle health. Human genetic deficiency in PCYT2 causes a severe disease with failure to thrive and progressive muscle weakness. Pcyt2 mutant zebrafish recapitulate the patient phenotypes, indicating that the role of PCYT2/PE in muscle is evolutionary conserved. Muscle specific Pcyt2 knockout mice exhibited failure to thrive, impaired muscle development, progressive muscle weakness, muscle loss, accelerated ageing, and reduced lifespan. Mechanistically, Pcyt2 deficiency affects mitochondrial bioenergetics and physicochemical properties of the myofiber membrane lipid bilayer, in particular under exercise strain. We also show that PCYT2 activity declines in the aging muscles of humans and mice. AAV-based delivery of PCYT2 rescued muscle weakness in Pcyt2 knock-out mice and, importantly, improved muscle strength in old mice, offering a novel therapeutic avenue for rare disease patients and muscle aging. Thus, PCYT2 plays a fundamental, specific, and conserved role in vertebrate muscle health, linking PCYT2 and PCYT2 synthesized PE lipids to severe muscle dystrophy, exercise intolerance and aging.

Abstract Maintaining and modulating the mechanical anisotropy is essential for biological processes. How this is achieved on the microscopic scale in living soft matter is however not always clear. Here we introduce Brillouin Light Scattering Anisotropy Microscopy (BLAM) for mapping the high-frequency viscoelastic anisotropy inside living cells. Following proof-of-principle experiments on muscle myofibers, we apply this to study two fundamental biological processes. In plant cell walls we show how a phase-transition driven switch between anisotropic-isotropic wall properties may lead to asymmetric growth. In mammalian cell nuclei we uncover a spatio-temporally oscillating elastic anisotropy correlated to chromatin condensation, with long range orientational correlations that may provide a dynamic framework for coordinating intra-nuclear processes. Our results highlight the direct and indirect role the high-frequency mechanics can play in providing dynamic structure that lead to the regulation of diverse fundamental processes in biological systems, and offer a means for studying these. BLAM should find diverse biomedical and material characterization applications.

Nintedanib (NIN), a multi-tyrosine kinase inhibitor clinically approved for idiopathic pulmonary fibrosis and lung cancer, is characterized by protonation-dependent lysosomotropic behavior and appearance of lysosome-specific fluorescence emission properties. Here we investigate whether spontaneous formation of a so far unknown NIN matter within the acidic cell compartment is underlying these unexpected emissive properties and investigate the consequences on lysosome functionality. Lysosomes of cells treated with NIN, but not non-protonatable NIN derivatives, exhibited lysosome-associated birefringence signals co-localizing with the NIN-derived fluorescence emission. Sensitivity of both parameters towards vATPase inhibitors confirmed pH-dependent, spontaneous adoption of novel crystalline NIN structures in lysosomes. Accordingly, NIN crystallization from buffer solutions resulted in formation of multiple crystal polymorphs with pH-dependent fluorescence properties. Cell-free crystals grown at lysosomal-like pH conditions resembled NIN-treated cell lysosomes concerning fluorescence pattern, photobleaching dynamics, and Raman spectra. However, differences in birefringence intensity and FAIM-determined anisotropy, as well as predominant association with (intra)lysosomal membrane structures, suggested formation of a semi-solid NIN crystalline matter in acidic lysosomes. Despite comparable target kinase inhibition, NIN, but not its non-protonatable derivatives, impaired lysosomal functionality, mediated massive cell vacuolization, enhanced autophagy, deregulated lipid metabolism, and induced atypical phospholipidosis. Moreover, NIN exerted distinct phototoxicity, strictly dependent on lysosomal microcrystallization events. The spontaneous formation of NIN crystalline structures was also observable in the gut mucosa of orally NIN-treated mice. Summarizing, the here-described kinase inhibition-independent impact of NIN on lysosomal functionality mediates several of its cell biological activities and might contribute to NIN adverse effects.

The polyadenylation binding protein nucleus 1 (PABPN1), a multifactorial regulator of mRNA processing, regulates muscle wasting and atrophy. Previously, we elucidated the PABPN1-dependent proteome and found that levels of structural proteins, sarcomeric and cytoskeletal, were highly altered. We identified MURC, a plasma membrane-associated protein, to be affected by the cytoskeletal stability and suggest that MURC is a novel marker for impaired regeneration in muscles. We also studied the spatial organization of muscle structural proteins in 2D and 3D cell models with reduced PABPN1 levels (named here as shPAB). We show that dysregulation of cytoskeletal proteins in the shPab proteome is associated with a cytoskeleton lacking a polarized organization in muscle cells. We show that consequently, the cell mechanical features as well as myogenic differentiation are significantly reduced. We then show that restoring cytoskeletal stability, by actin overexpression in shPAB was beneficial for cell fusion and for the expression of sarcomeric proteins in shPAB models. We suggest that poor cytoskeleton mechanical features are caused by altered expression levels and contribute to aging-associated muscle wasting and atrophy.