Whole-genome-sequencing (WGS) of human tumors has revealed distinct mutation patterns that hint at the causative origins of cancer. We examined mutational signatures in 324 WGS human-induced pluripotent stem cells exposed to 79 known or suspected environmental carcinogens. Forty-one yielded characteristic substitution mutational signatures. Some were similar to signatures found in human tumors. Additionally, six agents produced double-substitution signatures and eight produced indel signatures. Investigating mutation asymmetries across genome topography revealed fully functional mismatch and transcription-coupled repair pathways. DNA damage induced by environmental mutagens can be resolved by disparate repair and/or replicative pathways, resulting in an assortment of signature outcomes even for a single agent. This compendium of experimentally induced mutational signatures permits further exploration of roles of environmental agents in cancer etiology and underscores how human stem cell DNA is directly vulnerable to environmental agents.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiJjNjA0ZmFiYTVmMGU3OGJlMjIwNDk4ODM4OGFiMWI2NSIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc5MTUxMjA2fQ.CTKsE0-Qsf5SCdj2dj23SyFaUlM9RUWeWDvQeRJcbYD_IrC4Ljh3yf5CIuqcUECWGEVoEdITYP52wfkJBWH5Cq7HblYZMdL8aGF-57elq89RTe8K0IqOMoBma4Wn9d6ZsD1tsQqFa-6qBraA_pUmQxDqRYHHN9ftW-Ao9Et-lGsYPt3cREhTCBLMYqb_4Ssbu1cKnoU3mASZfGXiQlJxRtTNZllC9S2P7cbRSf9BleSsSGt-XZOAqDvLLuuvsj228-7j9MotR-T9LUteZMivfflp9zFrUk2x5_dIleGBaSbGM0vQMeuRKcb_5LIoSpZyOOG5yVYdNYtUn3I1XiOiqw(mp4, (142.75 MB) Download video

Analysis of developmental plasticity of bone marrow–derived cells (BMDCs) is complicated by the possibility of cell-cell fusion. Here we demonstrate that epithelial cells can develop from BMDCs without cell-cell fusion. We use the Cre/lox system together with β-galactosidase and enhanced green fluorescent protein expression in transgenic mice to identify epithelial cells in the lung, liver, and skin that develop from BMDCs without cell fusion.

Abstract Mutational signatures are imprints of pathophysiological processes arising through tumorigenesis. Here, we generate isogenic CRISPR-Cas9 knockouts (Δ) of 43 genes in human induced pluripotent stem cells, culture them in the absence of added DNA damage, and perform wholegenome sequencing of 173 daughter subclones. Δ OGG1 , Δ UNG , Δ EXO1 , Δ RNF168 , Δ MLH1 , Δ MSH2 , Δ MSH6 , Δ PMS1 , and Δ PMS2 produce marked mutational signatures indicative of being critical mitigators of endogenous DNA changes. Detailed analyses reveal that 8-oxo-dG removal by different repair proteins is sequence-context-specific while uracil clearance is sequencecontext-independent. Signatures of mismatch repair (MMR) deficiency show components of C>A transversions due to oxidative damage, T>C and C>T transitions due to differential misincorporation by replicative polymerases, and T>A transversions for which we propose a ‘reverse template slippage’ model. Δ MLH1 , Δ MSH6 , and Δ MSH2 signatures are similar to each other but distinct from Δ PMS2 . We validate these gene-specificities in cells from patients with Constitutive Mismatch Repair Deficiency Syndrome. Based on these experimental insights, we develop a classifier, MMRDetect, for improved clinical detection of MMR-deficient tumors.

Abstract Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is one of the most widely applied forms of adaptive immunotherapy. Both the detrimental graft-versus-host disease (GVHD) and the beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effects occurring after allo-HSCT are largely mediated by alloantigen-reactive donor T cells in the graft. Separating GVHD from GVL effects is a formidable challenge, and a greater understanding of donor T cell biology is required to accomplish the uncoupling of GVHD from GVL. Here, we tested a novel mouse model of β-catenin ( Cat-Tg ) in an allo-HSCT model. Our data show that T cells from Cat-Tg mice did not cause GVHD. Surprisingly, Cat-Tg T cells maintained the GVL effect. Donor T cells from Cat-Tg mice exhibited significantly lower inflammatory cytokine production and reduced donor T cell proliferation, while upregulating cytotoxic mediators that resulted in enhanced cytotoxicity. RNA sequencing data revealed changes in the expression of over 150 genes for CD4, and over 250 genes for CD8 + T cells involved in essential aspects of immune response and GVHD pathophysiology. Transgenic over-expression of human β-catenin primarily affects CD8 + T cell phenotype. Altogether, our data suggest that β-catenin is a druggable target for developing therapeutic strategies to reduce GVHD while preserving the beneficial GVL effects following allo-HSCT treatment.

SUMMARY The global outbreak of SARS-CoV-2 necessitates the rapid development of new therapies against COVID-19 infection. Here, we present the identification of 200 approved drugs, appropriate for repurposing against COVID-19. We constructed a SARS-CoV-2-induced protein (SIP) network, based on disease signatures defined by COVID-19 multi-omic datasets(Bojkova et al., 2020; Gordon et al., 2020), and cross-examined these pathways against approved drugs. This analysis identified 200 drugs predicted to target SARS-CoV-2-induced pathways, 40 of which are already in COVID-19 clinical trials(Clinicaltrials.gov, 2020) testifying to the validity of the approach. Using artificial neural network analysis we classified these 200 drugs into 9 distinct pathways, within two overarching mechanisms of action (MoAs): viral replication (130) and immune response (70). A subset of drugs implicated in viral replication were tested in cellular assays and two (proguanil and sulfasalazine) were shown to inhibit replication. This unbiased and validated analysis opens new avenues for the rapid repurposing of approved drugs into clinical trials.

Abstract Graft-versus-host disease (GVHD) is a leading cause of mortality following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). Mature donor T cells in the graft mediate graft-versus-leukemia (GVL) responses against residual tumor cells, which may persist after pre-transplant conditioning regimens. Importantly, the same mature T cells also mediate GVHD. The transcription factor T Cell Factor-1 (TCF-1) is critical for T cell development in the thymus. Using a unique mouse model of allo-HSCT leading to GVHD, we investigated the role of TCF-1 in alloactivated T cell functioning and in GVHD. Here, we report that loss of TCF-1 in mature CD4 T cells reduces GVHD severity and persistence, improving survival of recipient mice. This was due to reduced proliferation, survival, and cytokine production of T cells, as well as increased exhaustion. Gene pathways involved in cytokine response, immune signaling, chemokine signaling, cell cycle, and T cell differentiation were altered by loss of TCF-1 in donor cells. Our companion paper shows that regulation of alloactivated CD4 T cells by TCF-1 differs from regulation of CD8 T cells, suggesting that TCF-1 plays a unique role in each subset. Therefore, targeting of TCF-1 or downstream signaling pathways may be an effective strategy for reducing GVHD following allo-HSCT.

Abstract Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is a life-saving treatment for many malignant and nonmalignant diseases. Donor T cells contained within the graft prevent tumor recurrence via graft-versus-tumor (GVT) effects, however, also cause graft-versus-host disease (GVHD). Novel treatment strategies are therefore needed to allow maintenance of GVT while suppressing GVHD. Here we show using murine models, that targeting IL-2-inducible T cell kinase (ITK) in donor T cells reduces GVHD while preserving the beneficial GVT effects. Donor T cells from Itk -/- mice exhibit significantly reduced production of inflammatory cytokines and migration to GVHD target organs such as liver and small intestine, while maintaining GVT efficacy against primary B-ALL tumors. Itk -/- T cells exhibited reduced expression of IRF4 and decreased JAK/STAT signaling activity, but preserved cytotoxicity, which was accompanied by upregulation of Eomesodermin (Eomes), which was necessary for GVT function. A novel peptide inhibitor ITK signaling is also able to prevent GVHD. This novel peptide inhibitor also reduced cytokine production in mice and human T cells. Altogether, our data suggest that inhibiting ITK could be a therapeutic strategy to reduce GVHD while preserving the beneficial GVT effects following allo-HSCT treatment. Key Points Inhibiting ITK by a novel peptide significantly reduces GVHD but retains GVT. ITK deficient donor T cells exhibit minimal GVHD, but maintain GVT activity. ITK deficient donor T cells exhibit significantly reduced production of inflammatory cytokines and migration to GVHD target organs. Eomes is required for GVT effect.

Xeroderma pigmentosum (XP) is caused by defective nucleotide excision repair of DNA damage. This results in hypersensitivity to ultraviolet light and increased skin cancer risk, as sunlight-induced photoproducts remain unrepaired. However, many XP patients also display early-onset neurodegeneration, which leads to premature death. The mechanism of neurodegeneration is unknown. Here, we investigate XP neurodegeneration using pluripotent stem cells derived from XP patients and healthy relatives, performing functional multi-omics on samples during neuronal differentiation. We show substantially increased levels of 5′,8-cyclopurine and 8-oxopurine in XP neuronal DNA secondary to marked oxidative stress. Furthermore, we find that the endoplasmic reticulum stress response is upregulated and reversal of the mutant genotype is associated with phenotypic rescue. Critically, XP neurons exhibit inappropriate downregulation of the protein clearance ubiquitin-proteasome system (UPS). Chemical enhancement of UPS activity in XP neuronal models improves phenotypes, albeit inadequately. Although more work is required, this study presents insights with intervention potential.

Abstract Deregulated Fbxo7 expression is associated with many pathologies, including anaemia, male sterility, cancer, and Parkinson’s disease, demonstrating its critical role in a variety of cell types. Although Fbxo7 is an F-box protein that recruits substrates for SCF-type E3 ubiquitin ligases, it also promotes the formation of cyclin D/Cdk6/p27 complexes in an E3-ligase independent fashion. We discovered PFKP, the major gatekeeper of glycolysis, in a screen for Fbxo7 substrates. PFKP has been previously shown to be a critical substrate of Cdk6 for the viability of T-ALL cells. We investigated the molecular relationships between Fbxo7, Cdk6 and PFKP, and the functional effect Fbxo7 has on T cell metabolism, viability, and activation. Fbxo7 promotes Cdk6-independent ubiquitination and Cdk6-dependent phosphorylation of PFKP. Importantly Fbxo7-deficient cells have reduced Cdk6 activity, and haematopoietic and lymphocytic cell lines show a significant dependency on Fbxo7. Compared to WT cells, CD4 + T cells with reduced Fbxo7 expression show increased glycolysis, despite lower cell viability and activation levels. Metabolomic studies of activated CD4 + T cells confirm increased glycolytic flux in Fbxo7-deficient cells, as well as altered nucleotide biosynthesis and arginine metabolism. We show Fbxo7 expression is glucose-responsive at the mRNA and protein level, and we propose Fbxo7 inhibits PFKP and glycolysis via its activation of Cdk6.

Abstract Regulatory T cells (Tregs) are suppressive immune cells used for a variety of clinical and therapeutic applications. Canonical Tregs express CD4, FOXP3, and CD25, which are considered definitive markers of Treg status when used together. However, a subset of noncanonical Tregs expressing only CD4 and FOXP3 have recently been described in some infection contexts. The transcriptional regulation of these cells is still unclear. We found that loss of TCF-1 in all T cells in mice leads to expansion of these cells in multiple tissues in a cell-intrinsic fashion. This effect was not due to aberrant expression of FOXP3, as other functional Treg markers were also expressed. In addition, presence of TCF-1-deficient cells in a chimeric mouse induced increased production of noncanonical Tregs from WT donor cells. Therefore, targeting of TCF-1 may remove suppression on this Treg lineage, increasing the yield of these cells for use in the clinic. Summary sentence Loss of TCF-1 causes expansion of CD25- FOXP3+ noncanonical Tregs, and TCF-1-deficient T cells induce increased production of CD25- Tregs from WT cells.