Abstract Disrupted proteome homeostasis (proteostasis) in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) has been a major focus of research in the past two decades. However, the proteostasis processes that become disturbed in ALS are not fully understood. Obtaining more detailed knowledge of proteostasis disruption in association with different ALS-causing mutations will improve our understanding of ALS pathophysiology and may identify novel therapeutic targets and strategies for ALS patients. Here we describe the development and use of a novel high-content analysis (HCA) assay to investigate proteostasis disturbances caused by the expression of several ALS-causing gene variants. This assay involves the use of conformationally-destabilised mutants of firefly luciferase (Fluc) to examine protein folding/re-folding capacity in NSC-34 cells expressing ALS-associated mutations in the genes encoding superoxide dismutase-1 (SOD1 A4V ) and cyclin F (CCNF S621G ). We demonstrate that these Fluc isoforms can be used in high-throughput format to report on reductions in the activity of the chaperone network that result from the expression of SOD1 A4V , providing multiplexed information at single-cell resolution. In addition to SOD1 A4V and CCNF S621G , NSC-34 models of ALS-associated TDP-43, FUS, UBQLN2, OPTN, VCP and VAPB mutants were generated that could be screened using this assay in future work. For ALS-associated mutant proteins that do cause reductions in protein quality control capacity, such as SOD1 A4V , this assay has potential to be applied in drug screening studies to identify candidate compounds that can ameliorate this deficiency.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease involving the selective death of upper and lower motor neurons in the primary motor cortex and spinal cord. A hallmark of ALS pathology is the accumulation of ubiquitinated protein inclusions within motor neurons. Recent studies suggest the sequestration of ubiquitin (Ub) into inclusions reduces the availability of free Ub, which is essential for cellular function and survival. However, the dynamics of the Ub landscape in ALS have not yet been described. Here we show that Ub homeostasis is altered in a SOD1 cell model of ALS. Utilising fluorescently tagged Ub, we followed the distribution of Ub in living cells expressing SOD1 and show that Ub is present at the earliest stages of SOD1 aggregation. We also report that cells containing aggregates of mutant SOD1 have greater ubiquitin-proteasome system (UPS) dysfunction as measured by the accumulation of the fluorescent proteasome reporter tdTomatoCL1. Furthermore, SOD1 aggregation is associated with the redistribution of Ub and depletion of the free Ub pool. Ubiquitomics analysis indicates that mutant SOD1 is associated with a shift of Ub to a pool of supersaturated proteins including those associated with oxidative phosphorylation and metabolism, corresponding with altered mitochondrial morphology and function. Taken together, these results suggest misfolded SOD1 contributes to UPS dysfunction and that Ub homeostasis is an important target for monitoring pathological changes in ALS.

ABSTRACT Fatty liver is characterised by the expansion of lipid droplets and is associated with the development of many metabolic diseases, including insulin resistance, dyslipidaemia and cardiovascular disease. We assessed the morphology of hepatic lipid droplets and performed quantitative proteomics in lean, glucose-tolerant mice compared to high-fat diet (HFD) fed mice that displayed hepatic steatosis and glucose intolerance as well as high-starch diet (HStD) fed mice who exhibited similar levels of hepatic steatosis but remained glucose tolerant. Both HFD and HStD-fed mice had more and larger lipid droplets than Chow-fed animals. We observed striking differences in liver lipid droplet proteomes of HFD and HStD-fed mice compared to Chow-fed mice, with fewer differences between HFD and HStD. Taking advantage of our diet strategy, we identified a fatty liver lipid droplet proteome consisting of proteins common in HFD- and HStD-fed mice. Likewise, a proteome associated with glucose tolerance that included proteins common in Chow and HStD but not HFD-fed mice was identified. Notably, glucose intolerance was associated with changes in the ratio of adipose triglyceride lipase (ATGL) to perilipin 5 (PLIN5) in the lipid droplet proteome, suggesting dysregulation of neutral lipid homeostasis in glucose-intolerant fatty liver, which supports bioactive lipid synthesis and impairs hepatic insulin action. We conclude that our novel dietary approach uncouples ectopic lipid burden from insulin resistance-associated changes in the hepatic lipid droplet proteome.

SUMMARY Nutrient copper supply is critical for cell growth and differentiation, and its disturbance is associated with major pathologies including cancer and neurodegeneration. Although increasing copper bioavailability in late Precambrian facilitated emergence of novel cuproproteins, their intricate regulation by this essential trace element remains largely cryptic. We found that subtle rises in cellular copper strikingly increase polyubiquitination and accelerate protein degradation within 30 minutes in numerous mammalian cell lines. We track this surprising observation to allostery induced in the UBE2D ubiquitin conjugase clade through a conserved CXXXC sub-femtomolar-affinity Cu + binding motif. Thus, physiologic fluctuation in cytoplasmic Cu + is coupled to the prompt degradation of UBE2D protein targets, including p53. In Drosophila harboring a larval-lethal knockdown of the nearly identical fly orthologue UbcD1, complementation with human UBE2D2 restored near-normal development, but mutation of its CXXXC Cu + binding motif profoundly disrupted organogenesis. Nutrient Cu + emerges as a trophic allosteric modulator of UBE2D activity through a structural motif whose evolution coincides with animal multicellularity. One Sentence Summary Modulation of nutrient copper impacts protein turnover and animal morphogenesis through conserved allostery of ubiquitin E2D conjugases. Hilights Nutrient copper supply is critical for cell growth and differentiation The E2D clade of ubiquitin conjugases contains a sub-femtomolar-affinity Cu + binding motif Allosteric activation by Cu + markedly accelerates protein polyubiquitination This sensor couples physiologic fluctuations in cytoplasmic Cu + with the degradation rate of E2D targets, including p53 This metazoan signaling mechanism is critical for drosophila morphogenesis In Brief Conserved allostery of ubiquitin E2D conjugases links nutrient copper signaling to protein degradation and animal morphogenesis. Abstract Figure Graphical Abstract

Primary cilia are crucial for signal transduction in a variety of pathways, including Hedgehog and Wnt. Disruption of primary cilia formation (ciliogenesis) is linked to a number of developmental disorders (known as ciliopathies) and diseases, including cancer. The Ubiquitin-Proteasome System (UPS) component UBR5 was previously identified as a putative modulator of ciliogenesis in a functional genomics screen. UBR5 is an E3 Ubiquitin ligase that is frequently deregulated in tumours, but its biological role in cancer is largely uncharacterised, partly due to a lack of understanding of interacting proteins and pathways. We validated the effect of UBR5 depletion on primary cilia formation using a robust model of ciliogenesis, and identified CSPP1, a centrosomal and ciliary protein required for cilia formation, as a UBR5-interacting protein. We show that UBR5 ubiquitylates CSPP1, and that UBR5 is required for cytoplasmic organization of CSPP1-comprising centriolar satellites in centrosomal periphery. Hence, we have established a key role for UBR5 in ciliogenesis that may have important implications in understanding cancer pathophysiology.

Abstract Disrupted proteome homeostasis (proteostasis) in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) has been a major focus of research in the past two decades. Yet the exact processes that normally maintain proteostasis, but that are uniquely disturbed in motor neurons expressing diverse genetic mutations, remain to be established. Obtaining a better understanding of proteostasis disruption in association with different ALS-causing mutations will improve our understanding of ALS pathophysiology and may identify novel therapeutic targets and strategies for ALS patients. Here we describe the development and use of a novel high-content analysis (HCA) assay to investigate proteostasis disturbances caused by the expression of ALS-causing gene variants. This assay involves the use of conformationally-destabilised mutants of firefly luciferase (Fluc) to examine protein folding/re-folding capacity in NSC-34 cells expressing ALS-associated mutations in the genes encoding superoxide dismutase-1 (SOD1 A4V ) and cyclin F (CCNF S621G ). We demonstrate that these Fluc isoforms can be used in high-throughput format to report on reductions in the activity of the chaperone network that result from the expression of SOD1 A4V , providing multiplexed information at single-cell resolution. In addition to SOD1 A4V and CCNF S621G , NSC-34 models of ALS-associated TDP-43, FUS, UBQLN2, OPTN, VCP and VAPB mutants were generated that could be screened using this assay in future work. For ALS-associated mutant proteins that do cause reductions in protein quality control capacity, such as SOD1 A4V , this assay has potential to be applied in drug screening studies to identify candidate compounds that can ameliorate this deficiency. Graphical abstract Highlights Destabilised firefly luciferase (Fluc) mutants can be used in high-content analysis (HCA) assay format Fluc HCA assay enables information-rich reporting on chaperone network activity in cell models of ALS Expression of SOD1 A4V reduces chaperone network activity in NSC-34 cells

Cancer research in the news is often associated with sensationalising and inaccurate reporting, giving rise to false hopes and expectations. The role of study selection for cancer-related news stories is an important but less commonly acknowledged issue, as the outcomes of primary research are generally less reliable than those of meta-analyses and systematic reviews. Few studies have investigated the quality of research that makes the news and no previous analyses of the proportions of primary and secondary research in the news have been found in the literature. The main aim of this study was to investigate the nature and quality of cancer research covered in online news reports by four major news sources from USA, UK and Australia. We measured significant variation in reporting quality, and observed biases in many aspects of cancer research reporting, including the types of study selected for coverage, and in the spectrum of cancer types, gender of scientists, and geographical source of research represented. We discuss the implications of these finding for guiding accurate, contextual reporting of cancer research, which is critical in helping the public understand complex science and appreciate the outcomes of publicly funded research, avoid undermining trust in science, and assist informed decision-making.