We directly observed real-time production of single protein molecules in individual Escherichia coli cells. A fusion protein of a fast-maturing yellow fluorescent protein (YFP) and a membrane-targeting peptide was expressed under a repressed condition. The membrane-localized YFP can be detected with single-molecule sensitivity. We found that the protein molecules are produced in bursts, with each burst originating from a stochastically transcribed single messenger RNA molecule, and that protein copy numbers in the bursts follow a geometric distribution. The quantitative study of low-level gene expression demonstrates the potential of single-molecule experiments in elucidating the workings of fundamental biological processes in living cells.

Coordinating cell wall synthesis and cell division Most bacteria are protected by peptidoglycan cell walls, which must be remodeled to split the cell. Cell division requires the tubulin homolog FtsZ, a highly conserved cytoskeletal polymer that specifies the future site of division. Bisson-Filho et al. and Yang et al. found that the dynamic treadmilling of FtsZ filaments controls both the location and activity of the associated cell wall synthetic enzymes. This creates discrete sites of cell wall synthesis that circle around the division plane to divide the cell. Science , this issue p. 739 , p. 744

Abstract The FtsN protein of Escherichia coli and other proteobacteria is an essential and highly conserved bitopic membrane protein that triggers the inward synthesis of septal peptidoglycan (sPG) during cell division. Previous work has shown that the activation of sPG synthesis by FtsN involves a series of interactions of FtsN with other divisome proteins and the cell wall. Precisely how FtsN achieves this role is unclear, but a recent study has shown that FtsN promotes the relocation of the essential sPG synthase FtsWI from an FtsZ-associated track (where FtsWI is inactive) to an sPG-track (where FtsWI engages in sPG synthesis). Whether FtsN works by displacing FtsWI from the Z-track or capturing/retaining FtsWI on the sPG-track is not known. Here we use single-molecule imaging and genetic manipulation to investigate the organization and dynamics of FtsN at the septum and how they are coupled to sPG synthesis activity. We found that FtsN exhibits a spatial organization and dynamics distinct from those of the FtsZ-ring. Single FtsN molecules move processively as a single population with a speed of ∼ 9 nm s -1 , similar to the speed of active FtsWI molecules on the sPG-track, but significantly different from the ∼ 30 nm s -1 speed of inactive FtsWI molecules on the FtsZ-track. Furthermore, the processive movement of FtsN is independent of FtsZ’s treadmilling dynamics but driven exclusively by active sPG synthesis. Importantly, only the essential domain of FtsN, a three-helix bundle in the periplasm, is required to maintain the processive complex containing both FtsWI and FtsN on the sPG-track. We conclude that FtsN activates sPG synthesis by forming a processive synthesis complex with FtsWI exclusively on the sPG-track. These findings favor a model in which FtsN captures or retains FtsWI on the sPG-track rather than one in which FtsN actively displaces FtsWI from the Z-track.

Abstract In single-molecule localization based super-resolution microscopy (SMLM), a fluorophore stochastically switches between fluorescent- and dark-states, leading to intermittent emission of fluorescence, a phenomenon known as blinking. Intermittent emissions create multiple localizations belonging to the same molecule, resulting in blinking-artifacts within SMLM images. These artifacts are often interpreted as true biological assemblies, confounding quantitative analyses and interpretations. Multiple methods have been developed to eliminate these artifacts, but they either require additional experiments, arbitrary thresholds, or specific photo-kinetic models. Here we present a method, termed Distance Distribution Correction (DDC), to eliminate blinking-caused repeat localizations without any additional calibrations. The approach relies on the finding that the true pairwise distance distribution of different fluorophores in an SMLM image can be naturally obtained from the imaging sequence by using distances between localizations separated by a time much longer than the average fluorescence survival time. We show that using the true pairwise distribution we can define and then maximize the likelihood of obtaining a particular set of localizations void of blinking-artifacts, generating an accurate reconstruction of the underlying cellular structure. Using both simulated and experimental data, we show that DDC surpasses all previous existing blinking-artifact correction methodologies, resulting in drastic improvements in obtaining the closest estimate of the true spatial organization and number of fluorescent emitters in a wide range of applications. The simplicity and robustness of DDC will allow it to become the field standard in SMLM imaging, enabling the most accurate reconstruction and quantification of SMLM images to date.

ABSTRACT To divide, bacteria must synthesize and remodel their peptidoglycan (PG) cell wall, a protective meshwork that maintains cell shape. FtsZ, a tubulin homolog, dynamically assembles into a midcell band, recruiting division proteins including the PG synthases FtsW and FtsI. FtsWI are activated to synthesize PG and drive constriction at the appropriate time and place, however their activation pathway remains unresolved. In Caulobacter crescentus , FtsWI activity requires FzlA, an essential FtsZ-binding protein. Through time-lapse imaging and single-molecule tracking of C. crescentus FtsW and FzlA in perturbed genetic backgrounds, we demonstrate that FzlA is a limiting constriction activation factor that converts inactive, fast-moving FtsW to an active, slow-moving state. We find that FzlA interacts with the DNA translocase FtsK, and place FtsK genetically in a pathway with FzlA and FtsWI. Misregulation of the FzlA-FtsK-FtsWI pathway leads to heightened DNA damage and cell death. We propose that FzlA integrates the FtsZ ring, chromosome segregation, and PG synthesis to ensure robust and timely constriction during Caulobacter division.

ABSTRACT The bacterial divisome, a macromolecular machine that is composed of more than thirty proteins in E. coli , orchestrates the essential process of cell wall constriction during cell division. Novel antimicrobial strategies can target protein-protein interactions within the divisome and will benefit from insights into divisome structure and dynamics. In this work, we combined structure prediction, molecular dynamics simulation, single-molecule imaging, and mutagenesis to construct a model of the core complex of the E. coli divisome composed of the essential septal cell wall synthase complex formed by FtsW and FtsI, and its regulators FtsQ, FtsL, FtsB, and FtsN. We observed extensive interactions in four key regions in the periplasmic domains of the complex. FtsQ, FtsL, and FtsB scaffold FtsI in an extended conformation with the FtsI transpeptidase domain lifted away from the membrane through interactions among the C-terminal domains. FtsN binds between FtsI and FtsL in a region rich in residues with superfission (activating) and dominant negative (inhibitory) mutations. Mutagenesis experiments in cellulo and in silico revealed that the essential domain of FtsN functions as a tether to tie FtsI and FtsL together, impacting interactions between the anchor-loop of FtsI and the putative catalytic region of FtsW, suggesting a mechanism of how FtsN activates the cell wall synthesis activities of FtsW and FtsI.

Abstract Tau is a microtubule-associated protein, which promotes neuronal microtubule assembly and stability. Accumulation of tau into insoluble aggregates known as neurofibrillary tangles (NFTs) is a pathological hallmark of several neurodegenerative diseases. The current hypothesis is that small, soluble oligomeric tau species preceding NFT formation cause toxicity. However, thus far visualizing the spatial distribution of tau monomers and oligomers inside cells under physiological or pathological conditions has not been possible. Here, using single molecule localization microscopy (SMLM), we show that, in vivo , tau forms small oligomers on microtubules under physiological conditions. These physiological oligomers are distinct from those found in cells exhibiting tau aggregation and could be pre-cursors of aggregated tau in pathology. Further, using an unsupervised shape classification algorithm that we developed, we show that different tau phosphorylation states are associated with distinct tau aggregate species. Our work elucidates tau’s nanoscale composition under physiological and pathological conditions in vivo .

One Sentence Summary DNA replication establishes asymmetric epigenomes Summary One of the most fundamental questions in developmental biology concerns how cells with identical genomes differentiate into distinct cell types. One important context for understanding cell fate specification is asymmetric cell division, where the two daughter cells establish different cell fates following a single division. Many stem cells undergo asymmetric division to produce both a self-renewing stem cell and a differentiating daughter cell 1–5 . Here we show that histone H4 is inherited asymmetrically in asymmetrically dividing Drosophila male germline stem cells, similar to H3 6 . In contrast, both H2A and H2B are inherited symmetrically. By combining superresolution microscopy with the chromatin fiber method, we are able to study histone inheritance patterns on newly replicated chromatin fibers. Using this technique, we find asymmetric inheritance patterns for old and new H3, but symmetric inheritance patterns for old and new H2A on replicating sister chromatids. Furthermore, co-localization studies on isolated chromatin fibers and proximity ligation assays on intact nuclei reveal that old H3 are preferentially incorporated by the leading strand while newly synthesized H3 are enriched on the lagging strand. Finally, using a sequential nucleoside analog incorporation assay, we detect a high incidence of unidirectional DNA replication on germline-derived chromatin fibers and DNA fibers. The unidirectional fork movement coupled with the strand preference of histone incorporation could explain how old and new H3 are asymmetrically incorporated by replicating sister chromatids. In summary, our work demonstrates that the intrinsic asymmetries in DNA replication may help construct sister chromatids enriched with distinct populations of histones. Therefore, these results suggest unappreciated roles for DNA replication in asymmetrically dividing cells in multicellular organisms.

In this review, we explore the regulation of septal peptidoglycan (sPG) synthesis in bacterial cell division, a critical process for cell viability and proper morphology. Recent single-molecule imaging studies have revealed the processive movement of the FtsW:bPBP synthase complex along the septum, shedding light on the spatiotemporal dynamics of sPG synthases and their regulators. In diderm bacteria (E. coli and C. crescentus), the movement occurs at two distinct speeds, reflecting active synthesis or inactivity driven by FtsZ-treadmilling. In monoderm bacteria (B. subtilis, S. pneumoniae, and S. aureus), however, these enzymes exhibit only the active sPG-track-coupled processive movement. By comparing the dynamics of sPG synthases in these organisms and that of class-A penicillin-binding proteins in vivo and in vitro, we propose a unifying model for septal cell wall synthesis regulation across species, highlighting the roles of the sPG- and Z-tracks in orchestrating a robust bacterial cell wall constriction process.

Abstract Bacterial transcription has been studied extensively in vitro , which has provided indepth insight regarding transcription mechanisms. However, the live cell environment may impose different rules on transcription than the homogenous and simplified in vitro environment. How an RNA polymerase (RNAP) molecule searches rapidly through the vast nonspecific chromosomal DNA in the three-dimensional nucleoid space and binds a specific promoter sequence remains elusive. The kinetics of transcription in vivo could also be impacted by specific cellular environments including nucleoid organization and nutrient availability. In this work, we investigated the promoter search dynamics and transcription kinetics of RNAP in live E. coli cells. Using single-molecule tracking (SMT) and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and combining with different genetic, drug inhibition, and growth conditions, we observed that RNAP’s promoter search is facilitated by nonspecific DNA interactions and largely independent of nucleoid organization, growth condition, transcription activity, or promoter classes. RNAP’s transcription kinetics, however, is sensitive to these conditions and mainly modulated at the levels of actively engaged RNAP and the promoter escape rate. Our work establishes a foundation for further mechanistic studies of bacterial transcription in live cells.