Summary

 The response to DNA damage is critical for cellular homeostasis, tumor suppression, immunity, and gametogenesis. In order to provide an unbiased and global view of the DNA damage response in human cells, we undertook 31 CRISPR-Cas9 screens against 27 genotoxic agents in the retinal pigment epithelium-1 (RPE1) cell line. These screens identified 890 genes whose loss causes either sensitivity or resistance to DNA-damaging agents. Mining this dataset, we discovered that ERCC6L2 (which is mutated in a bone-marrow failure syndrome) codes for a canonical non-homologous end-joining pathway factor, that the RNA polymerase II component ELOF1 modulates the response to transcription-blocking agents, and that the cytotoxicity of the G-quadruplex ligand pyridostatin involves trapping topoisomerase II on DNA. This map of the DNA damage response provides a rich resource to study this fundamental cellular system and has implications for the development and use of genotoxic agents in cancer therapy.

ABSTRACT COVID-19 is a significant cause of morbidity and mortality in blood cancer patients, especially those on immunosuppressive therapy. Despite extensive research, the specific factor associated with SARS-CoV-2 infection that mediates the life-threatening inflammatory cytokine response in patients with severe COVID-19 remains unidentified. Herein we demonstrate that the virus-encoded Open Reading Frame 8 (ORF8) protein is abundantly secreted as a glycoprotein in vitro and in symptomatic patients with COVID-19. ORF8 specifically binds to the NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) in CD14 + monocytes to induce a non-canonical inflammasomal response, and a canonical response when the second activation signal is present. Levels of ORF8 protein in the blood correlate with severity and disease-specific mortality in patients with acute SARS-CoV-2 infection. Furthermore, the ORF8-induced inflammasome response was readily inhibited by the NLRP3 inhibitor MCC950 in vitro . Our study identifies a dominant cause of pathogenesis, its underlying mechanism, and a potential new treatment for severe COVID-19. Key points Secreted glycoprotein ORF8 induces monocytic pro-inflammatory cytokines involving the activation of the NLPR3 inflammasome pathway. ORF8 is prognostically present in the blood of symptomatic patients with covid-19 and is targetable with NLRP3 inhibitor MCC-950.

Abstract Mammalian cell lines are important expression systems for large proteins and protein complexes, particularly when the acquisition of post-translational modifications in the protein’s native environment is desired. However, low or variable transfection efficiencies are challenges that must be overcome to use such an expression system. Expression of recombinant proteins as a fluorescent protein fusion enables real-time monitoring of protein expression, and also provides an affinity handle for one-step protein purification using a suitable affinity reagent. Here we describe a panel of anti-GFP and anti-mCherry nanobody affinity matrices and their efficacy for purification of GFP/YFP or mCherry fusion proteins. We define the molecular basis by which they bind their target protein using X-ray crystallography. From these analyses we define an optimal pair of nanobodies for purification of recombinant protein tagged with GFP/YFP or mCherry, and demonstrate these nanobody-sepharose supports are stable to many rounds of cleaning and extended incubation in denaturing conditions. Finally, we demonstrate the utility of the mCherry-tag system by using it to purify recombinant human Topoisomerase 2α expressed in HEK293F cells. The mCherry-tag and GFP/YFP-tag expression systems can be utilized for recombinant protein expression individually or in tandem for mammalian protein expression systems where real-time monitoring of protein expression levels and a high-efficiency purification step is needed.

ABSTRACT The transcription of stress-inducible genes requires synchronized and robust activation, which is critical for organismal survival and homeostasis. The function of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is required for the activation of immediate early genes (IEGs), including EGR1 and FOS , for cell growth and proliferation 1–3 . In addition, recent studies have identified topoisomerase II (TOP2) as one of the important regulators of the transcriptional activation of IEGs 4–6 . However, the mechanism underlying transcriptional regulation involving TOP2 in IEG activation has remained unknown. Here, we demonstrate that ERK2, but not ERK1, is important for IEG transcriptional activation and report a critical ELK1 binding sequence for ERK2 function at the EGR1 gene. Our data indicate that both ERK1 and ERK2 extensively phosphorylate the C-terminal domain of TOP2B at mutual and distinctive residues. Although both ERK1 and ERK2 enhance the catalytic rate of TOP2B required to relax positive DNA supercoiling, ERK1 can relax the DNA by itself and produces a semi-relaxed DNA, which is apparently resistant to TOP2B catalysis. Inhibition of ERK2 kinase activity or ERK2 knock-down interferes with transcription and deregulates TOP2B in IEGs. Furthermore, we obtained the first cryo-EM structure of the human cell-purified TOP2B and etoposide together with the EGR1 transcriptional start site (50 nt; –30 to +20) that has the strongest affinity to TOP2B within –423 to +332. The structure elucidated in our studies showed TOP2B-mediated breakage and dramatic bending of the double-stranded DNA, comparable to previously reported structures of TOP2. Our cell-based analyses showed transcriptional activation by etoposide and transcriptional inhibition by ICRF193 at EGR1 and FOS , suggesting that TOP2B-mediated DNA break to favor transcriptional activation. Taken together, this study suggests that activated ERK2 phosphorylates TOP2B to regulate TOP2-DNA interactions and favor transcriptional activation in IEGs. We propose that TOP2B association, catalysis, and dissociation on its substrate DNA are important processes for regulating transcription and that ERK2-mediated TOP2B phosphorylation may be key for the catalysis and dissociation steps.

Abstract RNA polymerase II (Pol II)-dependent transcription in stimulus-inducible genes requires topoisomerase IIβ (TOP2B)-mediated DNA strand break and the activation of DNA damage response signaling in humans. Here, we report a novel function of the br east ca ncer 1 (BRCA1)- B RCA1 a ssociated r ing d omain 1 (BARD1) complex, in this process. We found that BRCA1 is phosphorylated at S1524 by the kinases ATM and ATR during gene activation and that this event is essential for productive transcription. Our in vitro biochemical analyses showed TOP2B and BARD1 interaction and colocalization in the EGR1 transcription start site (TSS) and that the BRCA1-BARD1 complex ubiquitinates TOP2B, which appears to stabilize TOP2B protein in the cell and binding to DNA. Intriguingly, BRCA1 phosphorylation at S1524 controls this interaction. In addition, genomic analyses indicated colocalization between TOP2B and BRCA1 in a large number of protein-coding genes. Together, these findings reveal the novel function of the BRCA1-BARD1 complex in gene expression and in the regulation of TOP2B during Pol II transcription. Significance Statement Maintaining genomic integrity against cellular and extracellular genotoxic elements is essential for normal cell growth and function. Recent studies indicated that stimulus-induced transcription provokes topoisomerase IIβ-mediated DNA strand break and DNA damage response signaling, requiring DNA repair to be coupled with transcription. Here, we present a novel role for the BRCA1-BARD1 complex in regulating the transcription of serum-inducible genes and the stability of topoisomerase IIβ. The mechanism involving topoisomerase IIβ ubiquitination by the BRCA1-BARD1 complex and the phosphorylation of BRCA1 S1524 upon transcriptional activation appears to function as a switch to the reaction. Our findings provide the first evidence of functional interaction between the BRCA1-BARD1 complex and topoisomerase IIβ in transcription in humans.

The response to DNA damage is critical for cellular homeostasis, tumor suppression, immunity and gametogenesis. In order to provide an unbiased and global view of the DNA damage response in human cells, we undertook 28 CRISPR/Cas9 screens against 25 genotoxic agents in the retinal pigment epithelium-1 (RPE1) cell line. These screens identified 840 genes whose loss causes either sensitivity or resistance to DNA damaging agents. Mining this dataset, we uncovered that ERCC6L2, which is mutated in a bone-marrow failure syndrome, codes for a canonical non-homologous end-joining pathway factor; that the RNA polymerase II component ELOF1 modulates the response to transcription-blocking agents and that the cytotoxicity of the G-quadruplex ligand pyridostatin involves trapping topoisomerase II on DNA. This map of the DNA damage response provides a rich resource to study this fundamental cellular system and has implications for the development and use of genotoxic agents in cancer therapy.