Abstract Engineered transactivation domains (TADs) combined with programmable DNA binding platforms have revolutionized synthetic transcriptional control. Despite recent progress in programmable CRISPR/Cas-based transactivation (CRISPRa) technologies, the TADs used in these systems often contain poorly tolerated elements and/or are prohibitively large for many applications. Here we defined and optimized minimal TADs built from human mechanosensitive transcription factors (MTFs). We used these components to construct potent and compact multipartite transactivation modules (MSN, NMS, and eN3×9) and to build the CRISPR- d Cas9 recruited e nhanced a ctivation m odule (CRISPR-DREAM) platform. We found that CRISPR-DREAM was specific, robust across mammalian cell types, and efficiently stimulated transcription from diverse regulatory loci. We also showed that MSN and NMS were portable across Type I, II, and V CRISPR systems, TALEs, and ZF proteins. Further, as proofs of concepts, we used dCas9-NMS to efficiently reprogram human fibroblasts into iPSCs and demonstrated that MTF TADs are efficacious and well tolerated in therapeutically important primary human cell types. Finally, we leveraged the compact and potent features of these engineered TADs to build new dual and all-in-one CRISPRa AAV systems. Altogether, these compact human TADs, fusion modules, and new delivery architectures should be valuable for synthetic transcriptional control in biomedical applications.

Opioids such as morphine produce analgesia via mu opioid receptor (MOR), but opioid receptor signaling is not fully understood. Here we report that morphine analgesia and MOR signaling require neuronal Programmed cell death protein-1 (PD-1). We found that morphine-induced antinociception following systemic or intrathecal injection was compromised in Pd1 knockout mice. Morphine analgesia was also abrogated in wild-type mice after treatment with Nivolumab, a clinically used anti-PD-1 monoclonal antibody. Morphine produced analgesia by suppressing calcium currents in DRG neurons and excitatory synaptic transmission in spinal cord neurons, but strikingly, both actions were impaired by PD-1 blockade. In a mouse model of bone cancer, the antinociceptive action of systemic morphine was compromised in Pd1 knockout mice. Finally, PD-L1 and morphine produce synergistic analgesia. Our findings demonstrate that PD-1 also acts as a neuro checkpoint inhibitor and mediates opioid-induced analgesia and MOR signaling in neurons.

Inhibitory GABA-ergic neurotransmission is fundamental for the adult vertebrate central nervous system and requires low chloride ion concentration in neurons. This basic ionic-homeostatic mechanism relies on expression and function of KCC2, a neuroprotective ionic transporter that extrudes neuronal chloride. Importantly, no other transporter can rescue KCC2 deficit, and attenuated expression of KCC2 is strongly associated with circuit malfunction in chronic pain, epilepsy, neuro-degeneration, neuro-trauma, and other neuro-psychiatric illnesses. To isolate Kcc2 gene expression-enhancing compounds, we screened 1057 cell growth-regulating compounds in cultured primary cortical neurons. We identified kenpaullone (KP), which enhanced Kcc2/KCC2 expression and function in cultured rodent and human neurons by inhibiting GSK3ß. KP effectively reduced pathologic pain in preclinical mouse models of nerve constriction injury and bone cancer. In nerve-injury pain, KP restored Kcc2 expression and GABA-evoked chloride reversal potential in the spinal cord dorsal horn. Delta-catenin, a phosphorylation-target of GSK3ß in neurons, activated the Kcc2 promoter via Kaiso transcription factor. Validating this new pathway in-vivo, transient spinal over-expression of delta-catenin mimicked KP analgesia. With relevance for pathologic pain, our discoveries of a newly repurposed compound and a novel genetically-encoded mechanism that each enhance Kcc2 gene expression enable us to re-normalize disrupted inhibitory neurotransmission through genetic re-programming.

Abstract Agonists of the innate immune regulator stimulator of interferon genes (STING) have shown great efficacy in promoting antitumor immunity in preclinical models, leading to their exploration in cancer immunotherapy trials. Patients with advanced stage cancers frequently suffer from severe pain as a result of bone metastasis and bone destruction, for which there is no efficacious treatment. Here, using multiple mouse models of metastatic bone cancer, we report that STING agonists confer remarkable protection against cancer pain, bone destruction, and local tumor burden. Repeated systemic administration of STING agonists robustly attenuated bone cancer-induced pain symptoms and improved locomotor function. Interestingly, STING agonists provided acute pain relief through direct neuronal modulation, as ex vivo incubation of STING agonists reduced excitability of pain-sensing nociceptive neurons from tumor-bearing mice. In addition, STING agonists protected local bone destruction and reduced local tumor burden through modulation of osteoclast and immune cell function in the tumor microenvironment, providing long-term cancer pain relief. Finally, these in vivo effects were dependent on host-intrinsic STING and Ifnar1 . Overall, STING activation provides unique advantages in controlling metastatic bone cancer pain through distinct and synergistic actions on nociceptors, immune cells, and osteoclasts.

ABSTRACT The parasympathetic nervous system (PNS) modulates postprandial glucose metabolism via innervating pancreas; however, its significance in the pathogenesis of type 2 diabetes (T2DM) remains unclear. Here we show that brain-specific serine/threonine-protein kinase 2 (Brsk2), accumulated in obese mouse islets, responds to PNS activation and initiates pre-absorptive insulin release. In inducible mouse models, excessive Brsk2 amplifies parasympathetic signaling to β cells and increases their secretion, ensuing insulin resistance and T2DM. Conversely, Brsk2 inhibition prevents and treats HFD-induced metabolic abnormities via avoiding β-cell oversecretion. Mechanistically, parasympathetic acetylcholine activates cholinergic receptor M3 (Chrm3), then Chrm3 recruits and stabilizes Brsk2, which in turn phosphorylates phospholipase A2 activating protein (Plaa). A Chrm3-Brsk2-Plaa axis stimulates β-cell hypersecretion during both pre-absorptive and absorptive stages in HFD-feeding mice, thus imposing insulin resistance and β-cell dysfunction. Blocking parasympathetic signaling to β cells by Brsk2 protein restoration, autonomic mediation drugs, or vagotomy restricted diabetes development. Moreover, three human BRSK2 variants are associated with hyperinsulinemia, insulin resistance, and T2DM in the Chinese population. These findings reveal that Brsk2 links parasympathetic nervous system to nutrition-overload induced T2DM.