Prions are unconventional infectious agents responsible for transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases. They are thought to be composed exclusively of the protease-resistant prion protein (PrPres) that replicates in the body by inducing the misfolding of the cellular prion protein (PrPC). Although compelling evidence supports this hypothesis, generation of infectious prion particles in vitro has not been convincingly demonstrated. Here we show that PrPC → PrPres conversion can be mimicked in vitro by cyclic amplification of protein misfolding, resulting in indefinite amplification of PrPres. The in vitro-generated forms of PrPres share similar biochemical and structural properties with PrPres derived from sick brains. Inoculation of wild-type hamsters with in vitro-produced PrPres led to a scrapie disease identical to the illness produced by brain infectious material. These findings demonstrate that prions can be generated in vitro and provide strong evidence in support of the protein-only hypothesis of prion transmission.

Prion diseases are caused by propagation of misfolded forms of the normal cellular prion protein PrPC, such as PrPBSE in bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle and PrPCJD in Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans1. Disruption of PrPC expression in mice, a species that does not naturally contract prion diseases, results in no apparent developmental abnormalities2,3,4,5. However, the impact of ablating PrPC function in natural host species of prion diseases is unknown. Here we report the generation and characterization of PrPC-deficient cattle produced by a sequential gene-targeting system6. At over 20 months of age, the cattle are clinically, physiologically, histopathologically, immunologically and reproductively normal. Brain tissue homogenates are resistant to prion propagation in vitro as assessed by protein misfolding cyclic amplification7. PrPC-deficient cattle may be a useful model for prion research and could provide industrial bovine products free of prion proteins.

Prions are the unconventional infectious agents responsible for transmissible spongiform encephalopathies, which appear to be composed mainly or exclusively of the misfolded prion protein (PrPSc). Prion replication involves the conversion of the normal prion protein (PrPC) into the misfolded isoform, catalyzed by tiny quantities of PrPSc present in the infectious material. We have recently developed the protein misfolding cyclic amplification (PMCA) technology to sustain the autocatalytic replication of infectious prions in vitro. Here we show that PMCA enables the specific and reproducible amplification of exceptionally minute quantities of PrPSc. Indeed, after seven rounds of PMCA, we were able to generate large amounts of PrPSc starting from a 1 × 10-12 dilution of scrapie hamster brain, which contains the equivalent of ∼26 molecules of protein monomers. According to recent data, this quantity is similar to the minimum number of molecules present in a single particle of infectious PrPSc, indicating that PMCA may enable detection of as little as one oligomeric PrPSc infectious particle. Interestingly, the in vitro generated PrPSc was infectious when injected in wild-type hamsters, producing a disease identical to the one generated by inoculation of the brain infectious material. The unprecedented amplification efficiency of PMCA leads to a several billion-fold increase of sensitivity for PrPSc detection as compared with standard tests used to screen prion-infected cattle and at least 4000 times more sensitivity than the animal bioassay. Therefore, PMCA offers great promise for the development of highly sensitive, specific, and early diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy and to further understand the molecular basis of prion propagation. Prions are the unconventional infectious agents responsible for transmissible spongiform encephalopathies, which appear to be composed mainly or exclusively of the misfolded prion protein (PrPSc). Prion replication involves the conversion of the normal prion protein (PrPC) into the misfolded isoform, catalyzed by tiny quantities of PrPSc present in the infectious material. We have recently developed the protein misfolding cyclic amplification (PMCA) technology to sustain the autocatalytic replication of infectious prions in vitro. Here we show that PMCA enables the specific and reproducible amplification of exceptionally minute quantities of PrPSc. Indeed, after seven rounds of PMCA, we were able to generate large amounts of PrPSc starting from a 1 × 10-12 dilution of scrapie hamster brain, which contains the equivalent of ∼26 molecules of protein monomers. According to recent data, this quantity is similar to the minimum number of molecules present in a single particle of infectious PrPSc, indicating that PMCA may enable detection of as little as one oligomeric PrPSc infectious particle. Interestingly, the in vitro generated PrPSc was infectious when injected in wild-type hamsters, producing a disease identical to the one generated by inoculation of the brain infectious material. The unprecedented amplification efficiency of PMCA leads to a several billion-fold increase of sensitivity for PrPSc detection as compared with standard tests used to screen prion-infected cattle and at least 4000 times more sensitivity than the animal bioassay. Therefore, PMCA offers great promise for the development of highly sensitive, specific, and early diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy and to further understand the molecular basis of prion propagation. Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) 2The abbreviations used are: TSE, transmissible spongiform encephalopathy; PMCA, protein misfolding cyclic amplification; sa PMCA, serial automated PMCA; BSE, bovine spongiform encephalopathy; PBS, phosphate-buffered saline; BSA, bovine serum albumin; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; PTA, phosphotungstic acid; PK, proteinase K. are neurodegenerative disorders of humans and animals. Historically, scrapie has been the most common TSE in animals, affecting sheep for over 200 years (1Collinge J. Annu. Rev. Neurosci. 2001; 24: 519-550Crossref PubMed Scopus (1117) Google Scholar). The most recent and worrisome outbreak of an animal TSE disease is bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle (2Prusiner S.B. Science. 1997; 278: 245-251Crossref PubMed Scopus (862) Google Scholar). BSE has important implications for human health, because the infectious agent can be transmitted to humans producing a new disease, termed variant Creutzfeldt-Jakob disease (3Will R.G. Ironside J.W. Zeidler M. Cousens S.N. Estibeiro K. Alperovitch A. Poser S. Pocchiari M. Hofman A. Smith P.G. Lancet. 1996; 347: 921-925Abstract PubMed Scopus (1891) Google Scholar, 4Collinge J. Lancet. 1999; 354: 317-323Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (401) Google Scholar). TSEs are characterized by an extremely long incubation period, followed by a brief and invariably fatal clinical disease (5Roos R. Gajdusek D.C. Gibbs Jr., C.J. Brain. 1973; 96: 1-20Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). To date no therapy or early diagnosis is available. The pathogen responsible for TSEs, called “prion,” is comprised mainly or exclusively of a misfolded protein named PrPSc, which is a post-translationally modified version of the normal prion protein (PrPC) (6Prusiner S.B. Science. 1982; 216: 136-144Crossref PubMed Scopus (4147) Google Scholar, 7Cohen F.E. Prusiner S.B. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 793-819Crossref PubMed Scopus (476) Google Scholar). During the course of the disease, prions replicate by the autocatalytic conversion of PrPC into PrPSc, triggered by the misfolded protein present in the infectious inoculum. The conversion seems to involve a conformational change whereby the α-helical content of the normal protein diminishes and the amount of β-sheet increases (8Pan K.M. Baldwin M. Njuyen J. Gassett M. Serban A. Groth D. Mehlhorn I. Prusiner S.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 10962-10966Crossref PubMed Scopus (2090) Google Scholar, 9Caughey B.W. Dong A. Bhat K.S. Ernst D. Hayes S.F. Caughey W.S. Biochemistry. 1991; 30: 7672-7680Crossref PubMed Scopus (748) Google Scholar). The structural changes are accompanied by alterations in the biochemical properties as follows: PrPC is soluble in nondenaturing detergents; PrPSc is insoluble; PrPC is readily digested by proteases; and PrPSc is partially resistant (7Cohen F.E. Prusiner S.B. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 793-819Crossref PubMed Scopus (476) Google Scholar, 10Baldwin M.A. Cohen F.E. Prusiner S.B. J. Biol. Chem. 1995; 270: 19197-19200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (73) Google Scholar). To understand the mechanism of prion conversion, Caughey and co-workers (11Kocisko D.A. Come J.H. Priola S.A. Chesebro B. Raymond G.J. Lansbury P.T. Caughey B. Nature. 1994; 370: 471-474Crossref PubMed Scopus (800) Google Scholar) developed a cell-free conversion reaction that mimics in many aspects the prion replication process. One of the limitations of the cell-free conversion method is the relatively low efficiency of PrPSc formation that diminishes its application to study the nature of the infectious agent and to attempt sensitive detection of the protein. More recently, we have developed a novel technique referred to as protein misfolding cyclic amplification (PMCA), in which it is possible to simulate prion replication in the test tube in an accelerated and efficient way (12Saborio G.P. Permanne B. Soto C. Nature. 2001; 411: 810-813Crossref PubMed Scopus (1034) Google Scholar). In a cyclic manner, conceptually analogous to PCR cycling, PrPSc is incubated with excess PrPC to enlarge the PrPSc aggregates, which are then sonicated to generate multiple smaller units for the continued formation of new PrPSc (13Soto C. Saborio G.P. Anderes L. Trends Neurosci. 2002; 25: 390-394Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (137) Google Scholar). We have reported previously proof-of-concept experiments in which the technology was applied to replicate the misfolded protein from diverse species (12Saborio G.P. Permanne B. Soto C. Nature. 2001; 411: 810-813Crossref PubMed Scopus (1034) Google Scholar, 14Soto C. Anderes L. Suardi S. Cardone F. Castilla J. Frossard M.J. Peano S. Saá P. Limido L. Carbonatto M. Ironside J. Torres J.M. Pocchiari M. Tagliavini F. FEBS Lett. 2005; 579: 638-642Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar). The newly generated protein exhibits the same biochemical, biological, and structural properties as brain-derived PrPSc, and strikingly, it is infectious to wild-type animals, producing a disease with characteristics that are identical to the illness produced by brain-isolated prions (15Castilla J. Saá P. Hetz C. Soto C. Cell. 2005; 121: 195-206Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (698) Google Scholar). The technology has been automated, leading to a dramatic increase in efficiency of amplification and its application to detect PrPSc in blood of hamsters experimentally infected with scrapie (16Castilla J. Saa P. Soto C. Nat. Med. 2005; 11: 982-985Crossref PubMed Scopus (282) Google Scholar). In this study we describe in detail the methodological aspects for efficient PMCA amplification and the characterization of the technology for reproducibility, specificity, and sensitivity. We also study the minimum number of molecules needed to trigger amplification and the application of the PMCA technique to generate infectious material in vitro. Our results demonstrate that PMCA is capable of detecting as little as ∼26 monomers of PrP, which, according to recent data on the minimal size of the infectious particle (17Silveira J.R. Raymond G.J. Hughson A.G. Race R.E. Sim V.L. Hayes S.F. Caughey B. Nature. 2005; 437: 257-261Crossref PubMed Scopus (762) Google Scholar), would correspond to a single molecule of oligomeric infectious PrPSc. The technique is highly reproducible and specific to amplify PrPSc, because no signal is detected when no PrPSc inoculum is present. Finally, our results show that PMCA enables the increase of infectivity by around 20 million-fold, converting a sample that is not infectious into a highly infectious one. These data demonstrate that PMCA has a similar power of amplification as PCR techniques used to amplify DNA and have great promise for the development of highly sensitive detection of PrPSc and for understanding the molecular basis of prion replication. Preparation of Tissue Homogenates—Healthy and sick animals were perfused with phosphate-buffered saline (PBS) plus 5 mm EDTA prior to harvesting the tissue. Ten percent brain homogenates (w/v) were prepared in conversion buffer (PBS containing 150 mm NaCl, 1.0% Triton X-100, 4 mm EDTA, and the Complete Protease Inhibitor Mixture from Roche Applied Science). The samples were clarified by a brief, low speed centrifugation (1500 rpm for 30 s) using an Eppendorf centrifuge, model 5414 (Hamburg, Germany). Dilutions of this brain homogenate were done in conversion buffer, and they are expressed in relation to the brain; for example, a 100-fold dilution is equivalent to a 1% brain homogenate. In Vivo Infectivity Studies—Syrian Golden hamsters were used as an experimental model of scrapie. Animals were 4-6-weeks old at the time of inoculation. Anesthetized animals were injected intracerebrally stereotaxically in the right hippocampus with 1 μl of the sample or intraperitoneally with 200 μl of sample as described previously (15Castilla J. Saá P. Hetz C. Soto C. Cell. 2005; 121: 195-206Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (698) Google Scholar). The onset of clinical disease was measured by scoring the animals twice a week using the following scale: 1, normal animal; 2, mild behavioral abnormalities, including hyperactivity and hypersensitivity to noise; 3, moderate behavioral problems, including tremor of the head, ataxia, wobbling gait, head bobbing, irritability, and aggressiveness; 4, severe behavioral abnormalities, including all of the above plus jerks of the head and body and spontaneous backrolls; 5, terminal stage of the disease in which the animal lies in the cage and is no longer able to stand up. Animals scoring level 4 during 2 consecutive weeks were considered sick and were sacrificed to avoid excessive pain using exposition to carbonic dioxide. The scrapie infectious material used in these studies was titrated and 1 LD50 was obtained in a brain dilution of ∼1 × 10-9. Brains were extracted and analyzed biochemically and histologically. The right cerebral hemisphere was frozen and stored at -70 °C for biochemical examination of PrPres using Western blot analysis as described below. The left hemisphere was fixed in 10% formaldehyde solution, cut into sections, and embedded in paraffin. Serial sections (6 μm thick) from each block were stained with hematoxylin-eosin, using standard protocols, or incubated with monoclonal antibodies recognizing PrP or the glial fibrillary acidic protein. Immunoreactions were developed using the peroxidase-antiperoxidase method, following the manufacturer's specifications. Antibody specificity was verified by absorption. To compare the pattern of histopathological damage among animals, we calculated the lesion profile, using a variation of the method employed in mice (18Fraser H. Dickinson A.G. J. Comp. Pathol. 1968; 78: 301-311Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar). Briefly, the severity of vacuolation was scored in a scale from 0 to 5 in seven different brain areas, including medulla, cerebellum, superior colliculus, hippocampus, and cerebral cortex occipital, frontal, and lateral. PMCA Procedure—Although the principle of PMCA remains the same as in our original publication (12Saborio G.P. Permanne B. Soto C. Nature. 2001; 411: 810-813Crossref PubMed Scopus (1034) Google Scholar), the system has been optimized and automated, thus enabling the routine processing of many more samples in the same amount of time while reaching a higher conversion efficiency. Aliquots of normal and scrapie brain homogenate prepared in conversion buffer were mixed and loaded onto 0.2-ml PCR tubes. Tubes were positioned on an adaptor placed on the plate holder of a microsonicator (Misonix model 3000, Farmingdale, NY) and programmed to perform cycles of 30 min of incubation at 37 °C followed by a 40-s pulse of sonication set at 60% potency. Samples were incubated without shaking and immersed in the water of the sonicator bath. and the entire microplate horn was kept inside an incubator at 37 °C. The detailed protocol, including troubleshooting, has been recently published elsewhere (19Castilla J. Saá P. Soto C. Lehmann S. Grassi J. Methods and Tools in Bioscience and Medicine. Techniques in Prion Research. Birkhauser Verlag, Basel2004: 198-213Google Scholar, 20Saa P. Castilla J. Soto C. Sigurdsson E.M. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Humana Press Inc., Totowa, NJ2004: 53-66Google Scholar, 21Castilla J. Saa P. Morales R.M. Abid K. Maundrell K. Soto C. Methods Enzymol. 2006; 412: 3-20Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar). Proteinase K Digestion—Samples were incubated with 50 μg/ml PK for 60 min at 45 °C. The digestion was stopped by adding electrophoresis sample buffer. In each experiment it is important to have a negative control consisting of normal brain homogenate and to check that PK digestion of PrPC is complete to avoid confusion between undigested PrPC and the signal from the PK-resistant core of PrPSc. For this purpose special care has to be taken to observe the switch in the molecular weight after PK digestion, characteristic of bona fide PrPSc. Western Blot—Proteins were fractionated by SDS-PAGE under reducing conditions, electroblotted into nitrocellulose membrane, and probed with 3F4 antibody (22Kascsak R.J. Rubenstein R. Merz P.A. Tonna-DeMasi M. Fersko R. Carp R.I. Wisniewski H.M. Diringer H. J. Virol. 1987; 61: 3688-3693Crossref PubMed Google Scholar) (Signet, Dedham, MA) diluted 1:5000 in PBS. The immunoreactive bands were visualized by enhanced chemiluminescence assay (Amersham Biosciences). Densitometric analysis was done by using a UVP Bioimaging system EC3 apparatus (Upland, CA). Statistical significance of the values was evaluated by Student's t test. ELISA—Twenty μl of serial dilutions of an infected hamster brain into 10% normal brain homogenate were treated with 50 μg/ml PK for 1 h at 45°C and 450 rpm. The digestion was stopped with 50 mm phenylmethylsulfonyl fluoride. The digested samples were mixed with PBS up to 100 μl, loaded onto a 96-well ELISA plate (Maxisorp surface treatment), and incubated for 1 h at 37 °C. The plates were blocked with 5% BSA inPBSfor 1 h at 37°C, followed by incubation for 1 h with the monoclonal antibody 3F4 (Signet, Dedham, MA) diluted 1:3000 in 1% BSA in PBS. The antibody was washed four times with 200 μl of PBS, 0.05% Tween 20, and samples were incubated with the polyclonal antibody anti-mouse IgG, conjugated with horseradish peroxidase (Amersham Biosciences), and diluted 1:1000 in 1% BSA in PBS. After four washes the samples were developed with ImmunoPure ABTS (Pierce) following the manufacturer's directions. PTA Precipitation—Twenty μl of serial dilutions of an infected hamster brain into 10% normal brain homogenate were first treated with benzonase (2.5 units/μl in PBS, 1 mm MgCl2) for 30 min at 37 °C with constant agitation. Thereafter, we added 4% PTA (prepared in 70 mm MgCl2, titrated with NaOH to pH 7.4) and incubated at 37 °C for 30 min with constant agitation. Samples were centrifuged at 15,800 × g for 30 min at 37 °C in an Eppendorf microcentrifuge. Pellet was resuspended in 20-30 μl of PBS containing 0.1% Sarkosyl. After treatment with PK, samples were analyzed by Western blot as described above. PrPSc Quantitation—To estimate the quantity and the number of molecules of PrPSc in our samples, we analyzed several dilutions of scrapie brain homogenate by Western blot in the same gel as aliquots of known amounts of recombinant hamster PrP (supplemental Fig. 1A). The signal intensity was evaluated by densitometry, and the quantity of PrP in the sample was estimated by extrapolation of the calibration curve prepared with recombinant PrP (supplemental Fig. 1B). To minimize artifacts because of saturated or weak signal, several different dilutions were measured, and each dilution was analyzed in triplicate. To standardize the signal among the different blots, the densitometric data were expressed relative to the value of the signal of the same quantity of normal brain homogenate (without PK treatment). PrPSc quantitation was also confirmed by ELISA using recombinant PrP as standard. In this way we estimated the average concentration of PrPSc in the scrapie brain used in our studies to be 67 ng/μl. The number of molecules of PrPSc detected was estimated by mathematical calculation of the dilution used and the known concentration of PrPSc in the brain homogenate. The PMCA Technology and Its Reproducibility—PMCA consists of cycles of accelerated prion replication. The basis for PMCA is the observation that prion replication follows a seeding-nucleation model in which oligomeric PrPSc in the infectious material converts PrPC by integrating monomeric proteins into the ends of the aggregate, inducing and stabilizing its misfolding (13Soto C. Saborio G.P. Anderes L. Trends Neurosci. 2002; 25: 390-394Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (137) Google Scholar, 23Caughey B. Kocisko D.A. Raymond G.J. Lansbury Jr., P.T. Chem. Biol. 1995; 2: 807-817Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar). PMCA is a cyclic process consisting of two phases. During the first phase the samples containing minute amounts of PrPSc and a large excess of PrPC were incubated to induce growing of PrPSc polymers. In the second phase the sample is sonicated to break down the polymers, multiplying the number of nuclei. In this way, after each cycle the number of “seeds” is increased in an exponential fashion. The number of cycles can be repeated as many times as needed to reach the amplification rate desired. For practical operation, the system has been automated by using a programmable plate sonicator, as described under “Experimental Procedures.” This improvement not only decreases processing time and allows for the routine processing of many more cycles than a single probe sonicator but also prevents loss of material. Cross-contamination is eliminated because there is no direct probe intrusion into the sample. Reproducibility of amplification was measured by monitoring the PrPSc signal obtained before and after PMCA cycling under different experimental conditions. Equivalent samples containing a 10,000-fold dilution of scrapie brain into 10% healthy hamster brain homogenate were placed in distinct positions of the microplate sonicator and subjected to 48 PMCA cycles. The levels of amplification were studied by Western blot after PK digestion (Fig. 1A), and data were quantitated by densitometric analysis of the Western blot signal (Fig. 1B). Although some small variability was observed on the signal obtained in distinct wells, the differences were not significant and could not be attributed to a position effect, but rather they probably reflect some small experimental variability. To analyze further the reproducibility of the procedure, equivalent samples containing a 10,000-fold dilution of scrapie brain homogenate into 10% healthy hamster brain homogenate were subjected to 48 PMCA cycles in experiments done on different days. Fig. 1C shows that at 7 distinct days the amplification efficiency was virtually the same. Again, densitometric analysis showed that the signal was not statistically different in the distinct experiments (Fig. 1D). For this experiment, the normal brain sample used on day 1 was freshly prepared, whereas for all the other days, frozen material was used. Therefore, no differences between fresh and frozen material were observed. However, it is important to note that brain substrate has to be frozen in aliquots to avoid repetitive freezing-thawing that decreases PMCA efficiency. The influence of different, but equivalent, inocula on the conversion efficiency was studied by amplifying preparations of 10,000-fold diluted scrapie brain homogenate obtained from five distinct hamsters into the same substrate (Fig. 1E). After 48 PMCA cycles, a large and similar conversion of PrPC into PrPSc was observed. A similar result was obtained when normal brain homogenate from five different hamsters was used as a substrate for the amplification of a unique PrPSc inoculum (Fig. 1G). However, densitometric analysis of the experiments shown in Fig. 1, E and G, indicate that in both cases one sample gave a statistically significant different level of amplification than the other four samples (Fig. 1, F and H, respectively). These differences are not because of changes in the levels of PrPSc or PrPC in the samples, which were not significantly different. These results suggest that perhaps individual variability on the expression of PrP or conversion factors may lead to changes on the extent of prion conversion in vitro. In none of the experiments shown in Fig. 1 was PrPSc detectable in samples containing the same material but kept frozen without amplification. Specificity of PMCA Amplification—Specificity of cyclic amplification was evaluated in a blind study in which 10 brain samples of scrapie-affected hamsters and 11 samples of healthy animals were subjected to 48 PMCA cycles, and PrPSc was detected by Western blot analysis after PK digestion (Fig. 2, A and B). The results show that although 100% of the samples derived from sick animals (Fig. 2, A and B, lanes 1, 2, 3, 5, 7, 11, 13, 17, 19, and 21) were positive after PMCA, none of the samples coming from normal animals (lanes 4, 6, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, and 20) show any significant PrPSc signal. Of the 10 positive control samples, 7 corresponded to a 10,000-fold dilution of brain, 2 corresponded to a 50,000-fold dilution (Fig. 2A, lanes 13 and 17 in), and 1 corresponded to a 100,000-fold dilution (Fig. 2A, lane 19). None of these 10 samples showed any PrPSc signal in Western blot without PMCA amplification (data not shown). The interpretation of the data is that, under the conditions used, PMCA leads to 100% specificity for PrPSc detection. As demonstrated before, the amplification rate using PMCA depends upon the number of incubation/sonication cycles carried out (12Saborio G.P. Permanne B. Soto C. Nature. 2001; 411: 810-813Crossref PubMed Scopus (1034) Google Scholar). Thus, we decided to evaluate whether a PrPSc-like signal might appear on negative samples after many PMCA cycles. For this purpose, a 10% healthy hamster brain homogenate in the absence (negative control) or in the presence (positive control) of an aliquot of a 50,000-fold diluted scrapie brain was subjected to 24, 48, 96, or 144 PMCA cycles, and the PrPSc signal was detected by Western blot analysis (Fig. 2C). The results clearly indicate that PrPSc reactivity was detected only after PMCA in the positive control samples with an intensity that depended upon the number of cycles performed. In comparison, in the negative control samples, no PrPSc was ever detected, regardless of the number of PMCA cycles carried out (Fig. 2C). Specificity was further studied in an even more challenging situation in which several rounds of PMCA were done after diluting the material to refresh the substrate. We have shown that PrPSc can be kept replicating indefinitely in vitro by several rounds of successive PMCA (15Castilla J. Saá P. Hetz C. Soto C. Cell. 2005; 121: 195-206Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (698) Google Scholar) and that serial PMCA enables the ultrasensitive detection of PrPSc in brain and blood samples (16Castilla J. Saa P. Soto C. Nat. Med. 2005; 11: 982-985Crossref PubMed Scopus (282) Google Scholar). Brains from healthy hamsters and from animals infected with the 263K scrapie strain were diluted 104-fold into a 10% normal hamster brain homogenate. Samples were subjected to 48 PMCA cycles. After this first round of PMCA, a small aliquot of the amplified samples was taken and diluted 10-fold into more normal brain homogenate. These samples were again amplified by 48 PMCA cycles. This procedure was repeated several times, and PrPSc generation was determined by Western blot analysis after PK digestion. As shown in Fig. 2D, 10 rounds of PMCA to reach a final dilution of the original brain equivalent to 10-13 led to continuous formation of PrPSc only when the initial inoculum was derived from scrapie-infected animals. No PrPSc was ever detected in the absence of PrPSc inoculum, indicating that the system retains high specificity, even after 480 PMCA cycles. These same samples were used for further amplification, and after a dilution of more than 10-63 of initial inoculum a robust and continuous amplification was observed in samples containing PrPSc. When many additional rounds of saPMCA were performed, we observed a scatter appearance of a protease-resistant band identical to PrPSc even in samples without PrPSc inoculum (data not shown). Spontaneous generation of PrPSc was seen mainly when more than 10 rounds of PMCA were done. At present we do not know whether this newly generated PrPSc is the result of cross-contamination or the de novo generation of PrPSc. More experiments need to be performed to analyze the reproducibility of this observation and to distinguish between these two possibilities. In case we ruled out the possibility of contamination, these findings would indicate that PMCA can amplify a low frequency event in which PrPC spontaneously converts into PrPSc. This could be the basis for the origin of sporadic prion diseases. Sensitivity of PMCA and Minimum Number of Molecules Detected after Amplification—We have recently reported that sensitivity of detection after 140 cycles of PMCA was increased by around 6600-fold (16Castilla J. Saa P. Soto C. Nat. Med. 2005; 11: 982-985Crossref PubMed Scopus (282) Google Scholar). We also reported previously that to further increase replication efficiency, we needed to refresh the substrate periodically using a methodology we termed serial automated PMCA (saPMCA) (16Castilla J. Saa P. Soto C. Nat. Med. 2005; 11: 982-985Crossref PubMed Scopus (282) Google Scholar). By performing two rounds of saPMCA, we were able to detect PrPSc up to a 5 × 10-10 dilution of scrapie hamster brain, to reach an increase of sensitivity of around 10 million-fold (16Castilla J. Saa P. Soto C. Nat. Med. 2005; 11: 982-985Crossref PubMed Scopus (282) Google Scholar). To estimate the minimum number of molecules of PrPSc that our technology can detect in a given sample, we diluted a scrapie brain homogenate 1 × 10-12-fold into conversion buffer and subjected this material to saPMCA. According to our estimations, the PrPSc concentration in the scrapie-infected brain used for these studies was ∼67 ng/μl (see “Experimental Procedures” and supplemental Fig. 1). This result indicates that a 1 × 10-12-fold dilution should contain ∼6.7 × 10-20 g/μl or 1.3 molecules of PrPSc monomer per μl. Because in our experiments we use a volume of 20 μl, the sample tested contains ∼26 molecules of monomeric PrPSc. Strikingly, after five rounds of saPMCA, we were able to detect a signal in one of the four replicates used, and after seven rounds of amplification, we detected a signal in three of the four replicates (Fig. 3). Importantly, no amplified product was detected when a 10-14-fold dilution of brain was used (a sample that should contain no molecules of PrPSc) or in any of the control samples in which no PrPSc was present (Fig. 3). No signal was detected either in a 10-13-fold dilution (data not shown). The serious consequences of the BSE epidemics and the

Significance This contribution reports on the application of gold nanorods to the detection of amyloids in Parkinson’s and prion diseases. We found that gold nanorods show no interaction with monomeric proteins but adsorb onto helical protein fibrils. Chiral amyloid templates induce helical arrangement of nanorods, giving rise to intense optical activity at the plasmon resonance wavelengths. This report shows the use of protein fibrils as templates for chiral nanoparticle assembly and development of a biodetection technique. We show this effect on a model recombinant protein, α-synuclein (involved in Parkinson’s disease), using CD, cryogenic transmission EM tomography, and theoretical simulations supporting the experimental findings. We additionally show application to identify patients with Parkinson’s disease from human brain homogenates.

Genetic discoveries of Alzheimer's disease are the drivers of our understanding, and together with polygenetic risk stratification can contribute towards planning of feasible and efficient preventive and curative clinical trials. We first perform a large genetic association study by merging all available case-control datasets and by-proxy study results (discovery n = 409,435 and validation size n = 58,190). Here, we add six variants associated with Alzheimer's disease risk (near APP, CHRNE, PRKD3/NDUFAF7, PLCG2 and two exonic variants in the SHARPIN gene). Assessment of the polygenic risk score and stratifying by APOE reveal a 4 to 5.5 years difference in median age at onset of Alzheimer's disease patients in APOE ɛ4 carriers. Because of this study, the underlying mechanisms of APP can be studied to refine the amyloid cascade and the polygenic risk score provides a tool to select individuals at high risk of Alzheimer's disease.

Abstract The Dominantly Inherited Alzheimer Network (DIAN) Observational Study is an international collaboration studying autosomal dominant Alzheimer disease (ADAD). This rare form of Alzheimer disease (AD) is caused by mutations in the presenilin 1 (PSEN1) , presenilin 2 (PSEN2) , or amyloid precursor protein ( APP ) genes. As individuals from these families have a 50% chance of inheriting the familial mutation, this provides researchers with a well-matched cohort of carriers vs non-carriers for case-control studies. An important trait of ADAD is that the age at symptom onset is highly predictable and consistent for each specific mutation, allowing researchers to estimate an individual’s point in their disease time course prior to symptom onset. Although ADAD represents only a small proportion (approximately 0.1%) of all AD cases, studying this form of AD allows researchers to investigate preclinical AD and the progression of changes that occur within the brain prior to AD symptom onset. Furthermore, the young age at symptom onset (typically 30-60 years) means age-related comorbidities are much less prevalent than in sporadic AD, thereby allowing AD pathophysiology to be studied independent of these confounds. A major goal of the DIAN Observational Study is to create a global resource for AD researchers. To that end, the current manuscript provides an overview of the DIAN magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography (PET) protocols and highlights the key imaging results of this study to date.

Abstract Two alternative architectures have been proposed for PrP Sc , the most notorious prion: a parallel in register β stack (PIRIBS) and a 4-rung β-solenoid (4RβS). We challenged these two models by measuring intermolecular 13 C- 13 C dipole-dipole couplings of 13 CO-labelled Phe residues in a fully infectious sample of recombinant bank vole PrP Sc (recBVPrP Sc ) using a PITHIRDS-CT solid state NMR (ssNMR) experiment. To our surprise, data strongly support a PIRIBS architecture. However, the mean distance measured (∼6.5 Å) suggests that a minimum of two of the three Phe residues are not perfectly stacked at the canonical ∼5 Å cross-β distance. Additional ssNMR experiments show some local conformational variability of the Phe residues within limits of a relatively high rigidity. The most parsimonious interpretation of our data is that recBVPrP Sc is arranged as a PIRIBS, although additional conformers with alternative architectures cannot be excluded, including a mixture of PIRIBS and 4RβS. Author summary PrP Sc is the most notorious prion. It is an infectious protein that cuases fatal neurodegenerative diseases in humans and animals. PrP Sc is the aberrant version of a brain protein, PrP C . PrP Sc and PrP C have the same prinary structure, but different secondary, tertiaty and quaternary structures. PrP Sc is capable of templating PrP C to convert to the PrP Sc conformation, which is the basis of its capacity to propagate. Two plausible structural models of PrP Sc have been proposed, the four-rung β-solenoid (4RβS) and the parallel in-register β stack (PIRIBS) model. In both cases the driving force of the templating mechanism consists of “sticky” surface β-strands; however, in the PIRIBS model all the β-strands that conform a PrP Sc monomer lie flat on a surface whereas in the 4RβS model they wind in a corkscrew fashion. Here, we analyzed fully infectious recombinant PrP Sc using a solid state NMR technique, PITHIRDS, that allows probing distances between specific labelled amino acid residues. To our surprise (as we have defended the 4RβS model in the past), results clearly show the presence of a PIRIBS structure in our sample.

Unlike other species, such as cattle, cats or humans, prion disease has never been described in dogs, even though they were similarly exposed to the bovine spongiform encephalopathy (BSE) agent. This resistance prompted a thorough analysis of the canine PRNP gene and the presence of a negatively charged amino acid residue in position 163 was readily identified as potentially fundamental as it differed from all known susceptible species. Furthermore, recent results from our group demonstrated that mouse PRNP with the dog substitution N158D (mouse equivalent to position 163) rendered mice resistant to prion infection. In the present study, a transgenic mouse model was generated expressing dog prion protein (with glutamic acid at position 163) and challenged intracerebrally with a panel of prion isolates (including cattle BSE, sheep scrapie, atypical sheep scrapie, atypical BSE-L, sheep-BSE and chronic wasting disease, among others) none of which could infect them. The brains of these mice were subjected to in vitro prion amplification and failed to find even minimal amounts of misfolded prions providing definitive experimental evidence that dogs are resistant to prion disease. Subsequently, a second transgenic model was generated in which aspartic acid in position 163 was substituted for asparagine (the most common amino acid in this position in prion susceptible species) and this mutation resulted in susceptibility to BSE-derived isolates. These findings strongly support the hypothesis that the amino acid residue at position 163 of canine PrP C is a major determinant of the exceptional resistance of the canidae family to prion infection and establish this as a promising therapeutic target for prion diseases.

PrPSc, the first described and most notorious prion, is the only protein known to cause epidemics of deadly disease. Its properties are encoded in its unique structure. Here we report a first solid state NMR study of a uniformly labelled (U-13C,15N)-Bank vole (BV) infectious recombinant PrPSc prion. C-C, C-H and N-H spectra were obtained with MAS rotation of the sample at up to 60 kHz. We obtained amino acid-type secondary structure information and used it to challenge a physically plausible atomistic model of PrPSc consisting of a 4-rung β solenoid recently proposed by us. In all cases, our model was compatible with the data. This study shows that elucidation of the structure of PrPSc is within reach using recombinant PrPSc, NMR, and our model as a guiding tool.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.