Long non-coding RNAs (lncRNAs) are largely heterogeneous and functionally uncharacterized. Here, using FANTOM5 cap analysis of gene expression (CAGE) data, we integrate multiple transcript collections to generate a comprehensive atlas of 27,919 human lncRNA genes with high-confidence 5′ ends and expression profiles across 1,829 samples from the major human primary cell types and tissues. Genomic and epigenomic classification of these lncRNAs reveals that most intergenic lncRNAs originate from enhancers rather than from promoters. Incorporating genetic and expression data, we show that lncRNAs overlapping trait-associated single nucleotide polymorphisms are specifically expressed in cell types relevant to the traits, implicating these lncRNAs in multiple diseases. We further demonstrate that lncRNAs overlapping expression quantitative trait loci (eQTL)-associated single nucleotide polymorphisms of messenger RNAs are co-expressed with the corresponding messenger RNAs, suggesting their potential roles in transcriptional regulation. Combining these findings with conservation data, we identify 19,175 potentially functional lncRNAs in the human genome. A catalogue of human long non-coding RNA genes and their expression profiles across samples from major human primary cell types, tissues and cell lines. Alistair Forrest, Piero Carninci and colleagues of the FANTOM Consortium provide a catalogue of human long non-coding RNA (lncRNA) genes and their expression profiles across samples from human primary cell types, tissues and cell lines. They used combined analyses of multiple data sets to identify 27,919 lncRNA genes with high-confidence 5′ ends, as well as a subset of 19,175 potentially functional lncRNA loci. The lncRNA catalogue and annotations are available through an open web resource.

Enhancers, critical determinants of cellular identity, are commonly recognized by correlative chromatin marks and gain-of-function potential, although only loss-of-function studies can demonstrate their requirement in the native genomic context. Previously, we identified an erythroid enhancer of human BCL11A, subject to common genetic variation associated with the fetal haemoglobin level, the mouse orthologue of which is necessary for erythroid BCL11A expression. Here we develop pooled clustered regularly interspaced palindromic repeat (CRISPR)-Cas9 guide RNA libraries to perform in situ saturating mutagenesis of the human and mouse enhancers. This approach reveals critical minimal features and discrete vulnerabilities of these enhancers. Despite conserved function of the composite enhancers, their architecture diverges. The crucial human sequences appear to be primate-specific. Through editing of primary human progenitors and mouse transgenesis, we validate the BCL11A erythroid enhancer as a target for fetal haemoglobin reinduction. The detailed enhancer map will inform therapeutic genome editing, and the screening approach described here is generally applicable to functional interrogation of non-coding genomic elements. A CRISPR-Cas9 approach is used to perform saturating mutagenesis of the human and mouse BCL11A enhancers, producing a map that reveals critical regions and specific vulnerabilities; BCL11A enhancer disruption is validated by CRISPR-Cas9 as a therapeutic strategy for inducing fetal haemoglobin by applying it in both mice and primary human erythroblast cells. BCL11A is a transcriptional repressor that inhibits expression of fetal globin genes in adults, and is a potential therapeutic target for the treatment of β-globinopathies such as β-thalassemia and sickle cell disease. The enhancer of BCL11A is subject to common genetic variation associated with fetal hemoglobin level. Here, Daniel Bauer and colleagues use a CRISPR–Cas9 approach to perform saturation mutagenesis of the human and mouse BCL11A enhancers, producing a map that reveals critical regions and specific vulnerabilities. They validate BCL11A enhancer disruption by CRISPR–Cas9 as a therapeutic strategy for inducing fetal haemoglobin by applying it in both mice and primary human erythroblast cells.

Fetal hemoglobin (HbF, α2γ2) level is genetically controlled and modifies severity of adult hemoglobin (HbA, α2β2) disorders, sickle cell disease, and β-thalassemia. Common genetic variation affects expression of BCL11A, a regulator of HbF silencing. To uncover how BCL11A supports the developmental switch from γ- to β- globin, we use a functional assay and protein binding microarray to establish a requirement for a zinc-finger cluster in BCL11A in repression and identify a preferred DNA recognition sequence. This motif appears in embryonic and fetal-expressed globin promoters and is duplicated in γ-globin promoters. The more distal of the duplicated motifs is mutated in individuals with hereditary persistence of HbF. Using the CUT&RUN approach to map protein binding sites in erythroid cells, we demonstrate BCL11A occupancy preferentially at the distal motif, which can be disrupted by editing the promoter. Our findings reveal that direct γ-globin gene promoter repression by BCL11A underlies hemoglobin switching.

Transfusion of red blood cells (RBCs) is a standard and indispensable therapy in current clinical practice. In vitro production of RBCs offers a potential means to overcome a shortage of transfusable RBCs in some clinical situations and also to provide a source of cells free from possible infection or contamination by microorganisms. Thus, in vitro production of RBCs may become a standard procedure in the future. We previously reported the successful establishment of immortalized mouse erythroid progenitor cell lines that were able to produce mature RBCs very efficiently. Here, we have developed a reliable protocol for establishing immortalized human erythroid progenitor cell lines that are able to produce enucleated RBCs. These immortalized cell lines produce functional hemoglobin and express erythroid-specific markers, and these markers are upregulated following induction of differentiation in vitro. Most importantly, these immortalized cell lines all produce enucleated RBCs after induction of differentiation in vitro, although the efficiency of producing enucleated RBCs remains to be improved further. To the best of our knowledge, this is the first demonstration of the feasibility of using immortalized human erythroid progenitor cell lines as an ex vivo source for production of enucleated RBCs.

Multipotent self-renewing haematopoietic stem cells (HSCs) regenerate the adult blood system after transplantation1, which is a curative therapy for numerous diseases including immunodeficiencies and leukaemias2. Although substantial effort has been applied to identifying HSC maintenance factors through the characterization of the in vivo bone-marrow HSC microenvironment or niche3–5, stable ex vivo HSC expansion has previously been unattainable6,7. Here we describe the development of a defined, albumin-free culture system that supports the long-term ex vivo expansion of functional mouse HSCs. We used a systematic optimization approach, and found that high levels of thrombopoietin synergize with low levels of stem-cell factor and fibronectin to sustain HSC self-renewal. Serum albumin has long been recognized as a major source of biological contaminants in HSC cultures8; we identify polyvinyl alcohol as a functionally superior replacement for serum albumin that is compatible with good manufacturing practice. These conditions afford between 236- and 899-fold expansions of functional HSCs over 1 month, although analysis of clonally derived cultures suggests that there is considerable heterogeneity in the self-renewal capacity of HSCs ex vivo. Using this system, HSC cultures that are derived from only 50 cells robustly engraft in recipient mice without the normal requirement for toxic pre-conditioning (for example, radiation), which may be relevant for HSC transplantation in humans. These findings therefore have important implications for both basic HSC research and clinical haematology. An albumin-free culture system for the long-term ex vivo expansion of mouse haematopoietic stem cells produces 236- to 899-fold expansion, and generates cultures that robustly engraft in recipient mice without toxic pre-conditioning.

Reactivating the fetal globin gene Mutation of adult-type globin genes causes sickle cell disease and thalassemia. Although treating these hemoglobinopathies with gene therapy is possible, there is a pressing need for pharmacologic approaches to treat general patient populations. One promising approach is to reactivate repressed expression of fetal-type hemoglobin (HbF) in adult erythroid cells. Masuda et al. reveal a molecular mechanism governing HbF repression as mediated by the LRF/ZBTB7A transcription factor. The study may encourage the development of new HbF reactivation therapies for hemoglobinopathies. Science , this issue p. 285

Haematopoietic stem cells (HSCs) are a rare cell type that reconstitute the entire blood and immune systems after transplantation and can be used as a curative cell therapy for a variety of haematological diseases1,2. However, the low number of HSCs in the body makes both biological analyses and clinical application difficult, and the limited extent to which human HSCs can be expanded ex vivo remains a substantial barrier to the wider and safer therapeutic use of HSC transplantation3. Although various reagents have been tested in attempts to stimulate the expansion of human HSCs, cytokines have long been thought to be essential for supporting HSCs ex vivo4. Here we report the establishment of a culture system that allows the long-term ex vivo expansion of human HSCs, achieved through the complete replacement of exogenous cytokines and albumin with chemical agonists and a caprolactam-based polymer. A phosphoinositide 3-kinase activator, in combination with a thrombopoietin-receptor agonist and the pyrimidoindole derivative UM171, were sufficient to stimulate the expansion of umbilical cord blood HSCs that are capable of serial engraftment in xenotransplantation assays. Ex vivo HSC expansion was further supported by split-clone transplantation assays and single-cell RNA-sequencing analysis. Our chemically defined expansion culture system will help to advance clinical HSC therapies.