Numerous intestinal diseases are characterized by immune cell activation and compromised epithelial barrier function. We have shown that cytokine treatment of epithelial monolayers increases myosin II regulatory light chain (MLC) phosphorylation and decreases barrier function and that these are both reversed by MLC kinase (MLCK) inhibition. The aim of this study was to determine the mechanisms by which interferon (IFN)-γ and tumor necrosis factor (TNF)-α regulate MLC phosphorylation and disrupt epithelial barrier function. We developed a model in which both cytokines were required for barrier dysfunction. Barrier dysfunction was also induced by TNF-α addition to IFN-γ-primed, but not control, Caco-2 monolayers. TNF-α treatment of IFN-γ-primed monolayers caused increases in both MLCK expression and MLC phosphorylation, suggesting that MLCK is a TNF-α-inducible protein. These effects of TNF-α were not mediated by nuclear factor-κB. However, at doses below those needed for nuclear factor-κB inhibition, sulfasalazine was able to prevent TNF-α-induced barrier dysfunction, MLCK up-regulation, and MLC phosphorylation. Low-dose sulfasalazine also prevented morphologically evident tight junction disruption induced by TNF-α. These data show that IFN-γ can prime intestinal epithelial monolayers to respond to TNF-α by disrupting tight junction morphology and barrier function via MLCK up-regulation and MLC phosphorylation. These TNF-α-induced events can be prevented by the clinically relevant drug sulfasalazine. Numerous intestinal diseases are characterized by immune cell activation and compromised epithelial barrier function. We have shown that cytokine treatment of epithelial monolayers increases myosin II regulatory light chain (MLC) phosphorylation and decreases barrier function and that these are both reversed by MLC kinase (MLCK) inhibition. The aim of this study was to determine the mechanisms by which interferon (IFN)-γ and tumor necrosis factor (TNF)-α regulate MLC phosphorylation and disrupt epithelial barrier function. We developed a model in which both cytokines were required for barrier dysfunction. Barrier dysfunction was also induced by TNF-α addition to IFN-γ-primed, but not control, Caco-2 monolayers. TNF-α treatment of IFN-γ-primed monolayers caused increases in both MLCK expression and MLC phosphorylation, suggesting that MLCK is a TNF-α-inducible protein. These effects of TNF-α were not mediated by nuclear factor-κB. However, at doses below those needed for nuclear factor-κB inhibition, sulfasalazine was able to prevent TNF-α-induced barrier dysfunction, MLCK up-regulation, and MLC phosphorylation. Low-dose sulfasalazine also prevented morphologically evident tight junction disruption induced by TNF-α. These data show that IFN-γ can prime intestinal epithelial monolayers to respond to TNF-α by disrupting tight junction morphology and barrier function via MLCK up-regulation and MLC phosphorylation. These TNF-α-induced events can be prevented by the clinically relevant drug sulfasalazine. A principal function of epithelial surfaces is the maintenance of a barrier to hydrophilic solutes. In intestinal epithelium, this barrier function is compromised in a spectrum of infectious, immune-mediated, and idiopathic diseases.1Clayburgh DR Shen L Turner JR A porous defense: the leaky epithelial barrier in intestinal disease.Lab Invest. 2004; 84: 282-291Crossref PubMed Scopus (384) Google Scholar In Crohn's disease these barrier defects, measured as increases in paracellular permeability, may precede clinical evidence of disease,2Irvine EJ Marshall JK Increased intestinal permeability precedes the onset of Crohn's disease in a subject with familial risk.Gastroenterology. 2000; 119: 1740-1744Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (226) Google Scholar can serve as markers of impending disease reactivation,3Wyatt J Vogelsang H Hubl W Waldhoer T Lochs H Intestinal permeability and the prediction of relapse in Crohn's disease.Lancet. 1993; 341: 1437-1439Abstract PubMed Scopus (541) Google Scholar and correlate with systemic immune activation.4Yacyshyn BR Meddings JB CD45RO expression on circulating CD19+ B cells in Crohn's disease correlates with intestinal permeability.Gastroenterology. 1995; 108: 132-137Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (92) Google Scholar Thus, defects in epithelial barrier function are intimately associated with Crohn's disease pathogenesis. One feature common to Crohn's disease and other intestinal diseases with compromised barrier function is TH1-polarized immune activation, with associated elevations of mucosal interferon (IFN)-γ and tumor necrosis factor (TNF)-α. Several lines of evidence suggest that these cytokine elevations are responsible for the observed barrier defects. First, in vitro studies have shown that, at relatively high doses, IFN-γ and TNF-α can induce barrier dysfunction in cultured epithelial monolayers.5Madara JL Loosening tight junctions.J Clin Invest. 1989; 83: 1089-1094Crossref PubMed Scopus (283) Google Scholar, 6Mullin JM Snock KV Effect of tumor necrosis factor on epithelial tight junctions and transepithelial permeability.Cancer Res. 1990; 50: 2172-2176PubMed Google Scholar, 7Ma TY Iwamoto GK Hoa NT Akotia V Pedram A Boivin MA Said HM TNF-alpha-induced increase in intestinal epithelial tight junction permeability requires NF-kappa B activation.Am J Physiol. 2004; 286: G367-G376Crossref Scopus (20) Google Scholar, 8Bruewer M Luegering A Kucharzik T Parkos CA Madara JL Hopkins AM Nusrat A Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.J Immunol. 2003; 171: 6164-6172PubMed Google Scholar, 9Schmitz H Fromm M Bentzel CJ Scholz P Detjen K Mankertz J Bode H Epple HJ Riecken EO Schulzke JD Tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) regulates the epithelial barrier in the human intestinal cell line HT-29/B6.J Cell Sci. 1999; 112: 137-146Crossref PubMed Google Scholar At lower doses, these cytokines can synergize to disrupt barrier function in vitro.8Bruewer M Luegering A Kucharzik T Parkos CA Madara JL Hopkins AM Nusrat A Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.J Immunol. 2003; 171: 6164-6172PubMed Google Scholar, 10Taylor CT Dzus AL Colgan SP Autocrine regulation of epithelial permeability by hypoxia: role for polarized release of tumor necrosis factor alpha.Gastroenterology. 1998; 114: 657-668Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar, 11Zolotarevsky Y Hecht G Koutsouris A Gonzalez DE Quan C Tom J Mrsny RJ Turner JR A membrane-permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease.Gastroenterology. 2002; 123: 163-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar In vivo, both in human patients and animal models, TNF-α and IFN-γ antagonism can diminish disease severity and restore barrier function.12Musch MW Clarke LL Mamah D Gawenis LR Zhang Z Ellsworth W Shalowitz D Mittal N Efthimiou P Alnadjim Z Hurst SD Chang EB Barrett TA T cell activation causes diarrhea by increasing intestinal permeability and inhibiting epithelial Na+/K+-ATPase.J Clin Invest. 2002; 110: 1739-1747Crossref PubMed Scopus (155) Google Scholar, 13Brown GR Lindberg G Meddings J Silva M Beutler B Thiele D Tumor necrosis factor inhibitor ameliorates murine intestinal graft-versus-host disease.Gastroenterology. 1999; 116: 593-601Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (74) Google Scholar, 14Ferrier L Mazelin L Cenac N Desreumaux P Janin A Emilie D Colombel JF Garcia-Villar R Fioramonti J Bueno L Stress-induced disruption of colonic epithelial barrier: role of interferon-gamma and myosin light chain kinase in mice.Gastroenterology. 2003; 125: 795-804Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar, 15Suenaert P Bulteel V Lemmens L Noman M Geypens B Van Assche G Geboes K Ceuppens JL Rutgeerts P Anti-tumor necrosis factor treatment restores the gut barrier in Crohn's disease.Am J Gastroenterol. 2002; 97: 2000-2004Crossref PubMed Google Scholar Thus, TNF-α and IFN-γ are critical to the barrier disruption that occurs both in vitro and in vivo. Although both in vitro and in vivo data confirm that TNF-α and IFN-γ can cause dysfunction of the epithelial tight junction barrier, the mechanisms of this effect remain unknown. TNF-α can cause epithelial apoptosis, but this does not appear to be the mechanism by which barrier function is compromised.8Bruewer M Luegering A Kucharzik T Parkos CA Madara JL Hopkins AM Nusrat A Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.J Immunol. 2003; 171: 6164-6172PubMed Google Scholar, 11Zolotarevsky Y Hecht G Koutsouris A Gonzalez DE Quan C Tom J Mrsny RJ Turner JR A membrane-permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease.Gastroenterology. 2002; 123: 163-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar, 16Madara JL Maintenance of the macromolecular barrier at cell extrusion sites in intestinal epithelium: physiological rearrangement of tight junctions.J Membr Biol. 1990; 116: 177-184Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar, 17Rosenblatt J Raff MC Cramer LP An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.Curr Biol. 2001; 11: 1847-1857Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (416) Google Scholar Other mechanisms may be involved in cytokine-induced barrier dysfunction, including down-regulation of the tight junction proteins ZO-1 and occludin,18Mankertz J Tavalali S Schmitz H Mankertz A Riecken EO Fromm M Schulzke JD Expression from the human occludin promoter is affected by tumor necrosis factor alpha and interferon gamma.J Cell Sci. 2000; 113: 2085-2090PubMed Google Scholar, 19Youakim A Ahdieh M Interferon-gamma decreases barrier function in T84 cells by reducing ZO-1 levels and disrupting apical actin.Am J Physiol. 1999; 276: G1279-G1288PubMed Google Scholar decreased Na+-K+ ATPase activity,20Sugi K Musch MW Field M Chang EB Inhibition of Na+,K+-ATPase by interferon gamma down-regulates intestinal epithelial transport and barrier function.Gastroenterology. 2001; 120: 1393-1403Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (133) Google Scholar or nuclear factor (NF)-κB activation.7Ma TY Iwamoto GK Hoa NT Akotia V Pedram A Boivin MA Said HM TNF-alpha-induced increase in intestinal epithelial tight junction permeability requires NF-kappa B activation.Am J Physiol. 2004; 286: G367-G376Crossref Scopus (20) Google Scholar Nonetheless, little is known of the biochemical events that mediate TNF-α- and IFN-γ-induced barrier dysfunction. We and others have shown that myosin II activation, as indicated by phosphorylation of myosin II regulatory light chain (MLC), is involved in physiological and pathophysiological tight junction regulation.21Hecht G Pestic L Nikcevic G Koutsouris A Tripuraneni J Lorimer DD Nowak G Guerriero Jr, V Elson EL Lanerolle PD Expression of the catalytic domain of myosin light chain kinase increases paracellular permeability.Am J Physiol. 1996; 271: C1678-C1684PubMed Google Scholar, 22Yuhan R Koutsouris A Savkovic SD Hecht G Enteropathogenic Escherichia coli-induced myosin light chain phosphorylation alters intestinal epithelial permeability.Gastroenterology. 1997; 113: 1873-1882Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (203) Google Scholar, 23Turner JR Angle JM Black ED Joyal JL Sacks DB Madara JL Protein kinase C-dependent regulation of transepithelial resistance: the roles of myosin light chain and myosin light chain kinase.Am J Physiol. 1999; 277: C554-C562PubMed Google Scholar, 24Turner JR Black ED Ward J Tse CM Uchwat FA Alli HA Donowitz M Madara JL Angle JM Transepithelial resistance can be regulated by the intestinal brush border Na+-H+ exchanger NHE3.Am J Physiol. 2000; 279: C1918-C1924Google Scholar, 25Turner JR Cohen DE Mrsny RJ Madara JL Noninvasive in vivo analysis of human small intestinal paracellular absorption: regulation by Na+-glucose cotransport.Dig Dis Sci. 2000; 45: 2122-2126Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar, 26Turner JR Rill BK Carlson SL Carnes D Kerner R Mrsny RJ Madara JL Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with myosin light-chain phosphorylation.Am J Physiol. 1997; 273: C1378-C1385PubMed Google Scholar In the course of studies on this topic, we showed that treatment of intestinal epithelial monolayers with IFN-γ and TNF-α induced both barrier dysfunction and increased MLC phosphorylation.11Zolotarevsky Y Hecht G Koutsouris A Gonzalez DE Quan C Tom J Mrsny RJ Turner JR A membrane-permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease.Gastroenterology. 2002; 123: 163-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar We have also found that inhibition of MLC kinase (MLCK) both reduces MLC phosphorylation and restores barrier function.11Zolotarevsky Y Hecht G Koutsouris A Gonzalez DE Quan C Tom J Mrsny RJ Turner JR A membrane-permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease.Gastroenterology. 2002; 123: 163-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar Thus, our previous report suggests that MLCK-mediated MLC phosphorylation is critical to IFN-γ- and TNF-α-induced barrier dysfunction. However, the mechanism by which MLCK increases MLC phosphorylation was not identified. In the present studies we sought to define the mechanisms by which IFN-γ and TNF-α cause increases in MLC phosphorylation and concomitant barrier dysfunction in intestinal epithelia. The data show that IFN-γ primes intestinal epithelia to respond to TNF-α by increasing MLCK expression. This is followed by increases in MLC phosphorylation and barrier dysfunction. Sulfasalazine (SSA), an agent effective in the treatment of inflammatory bowel disease, prevents this barrier dysfunction by blocking MLCK up-regulation as well as increased MLC phosphorylation. However, this protective effect of SSA does not require NF-κB-inhibition. Thus, these data identify MLCK as a cytokine-inducible protein and also provide new insight into the mechanisms of epithelial barrier dysfunction in intestinal disease. Caco-2 cells were grown as monolayers on collagen-coated polycarbonate membrane Transwell supports (Corning-Costar, Acton, MA) and used 17 to 20 days after confluence, as described previously.26Turner JR Rill BK Carlson SL Carnes D Kerner R Mrsny RJ Madara JL Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with myosin light-chain phosphorylation.Am J Physiol. 1997; 273: C1378-C1385PubMed Google Scholar Transwell supports with 0.33- and 5-cm2 surface areas were used for electrophysiological and biochemical studies, respectively. Cytokines (R&D Systems, Minneapolis, MN), were added to the basal chamber without manipulating the apical media. SSA, 5-aminosalicylic acid, sulfapyridine, and 4-aminosalicylic acid (MP Biochemicals, Aurora, OH) and curcumin, triptolide, capsaicin, BAY 11-7085, SN50, and MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) were also added to the basal chamber only. Transepithelial resistance (TER) was measured with an epithelial voltohmmeter (EVOM; World Precision Instruments, Sarasota, FL). In all experiments the TER of control monolayers was ∼240 Ω·cm2 after subtraction of fluid resistance (Figure 1A). To facilitate comparisons between experiments, the TER of all monolayers was typically normalized to that of control monolayers in the same experiment. Flux of fluorescein isothiocyanate-labeled dextran (molecular weight, 3kD; Molecular Probes, Eugene, OR) across Caco-2 monolayers was assayed as described previously.10Taylor CT Dzus AL Colgan SP Autocrine regulation of epithelial permeability by hypoxia: role for polarized release of tumor necrosis factor alpha.Gastroenterology. 1998; 114: 657-668Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar, 27Sanders SE Madara JL McGuirk DK Gelman DS Colgan SP Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: a rapid screening method using fluorescein dextrans.Epithelial Cell Biol. 1995; 4: 25-34PubMed Google Scholar Briefly, monolayers were washed free of media and cytokines and transferred to Hanks’ balanced salt solution. The apical chamber was gently aspirated and replaced with 50 μl of 1 mg/ml of fluorescein isothiocyanate-dextran (1 mg/ml). The monolayers were rotated on an orbital shaker (60 rpm) at 37°C, and samples (50 μl) were removed from the basal chamber after 30 and 60 minutes. Fluorescence of these samples was determined using a fluorescent plate reader (Synergy HT; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). Molar flux was calculated from a standard curve that was prepared daily. Lysates of Caco-2 monolayers grown on 5-cm2 Transwell supports were separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) and transferred to polyvinylidene difluoride membranes, as described previously.26Turner JR Rill BK Carlson SL Carnes D Kerner R Mrsny RJ Madara JL Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with myosin light-chain phosphorylation.Am J Physiol. 1997; 273: C1378-C1385PubMed Google Scholar For NF-κB analyses, nuclear fractions were prepared by using the NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). After blocking the membranes were blotted using antibodies to MLCK (clone K36; Sigma, St. Louis, MO), ZO-1, occludin, claudin-1, and NF-κB RelA p65 (Zymed, South San Francisco, CA), caspase-3, caspase-8, and poly ADP-ribose polymerase (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), and total or phosphorylated MLC.28Berglund JJ Riegler M Zolotarevsky Y Wenzl E Turner JR Regulation of human jejunal transmucosal resistance and MLC phosphorylation by Na+-glucose cotransport.Am J Physiol. 2001; 281: G1487-G1493Google Scholar After incubation with peroxidase-conjugated secondary antibodies (Cell Signaling Technology), blots were visualized by enhanced chemiluminescence, as described previously.26Turner JR Rill BK Carlson SL Carnes D Kerner R Mrsny RJ Madara JL Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with myosin light-chain phosphorylation.Am J Physiol. 1997; 273: C1378-C1385PubMed Google Scholar Densitometry of immunoblot data was performed using Metamorph 6.2 (Universal Imaging Corp., Downingtown, PA). Caco-2 monolayers grown on 0.33-cm2 Transwell supports were fixed with 1% paraformaldehyde and permeabilized in 0.1% Triton X-100 in phosphate-buffered saline. After incubation with mouse anti-ZO-1, rabbit anti-occludin, or rabbit anti-claudin-1 antibodies, monolayers were washed and incubated with Alexa 594-conjugated secondary antibodies and Hoechst 33342 (Molecular Probes), as indicated. Monolayers were mounted in Slowfade (Molecular Probes) and imaged using a Leica DMLB epifluorescence microscope equipped with an 88000 filter set (Chroma Technology, Brattleboro, VT) and a Coolsnap HQ camera (Roper Scientific, Tucson, AZ) controlled by MetaMorph 6.2. Postacquisition deconvolution and serial reconstruction used Autodeblur 9 (AutoQuant Imaging, Inc., Watervliet, NY) for 10 iterations. pNFκB-TA-Luc (Clontech, Palo Alto, CA) was transiently transfected into freshly trypsinized Caco-2 cells, in suspension, using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) and the cells were plated on 12-well inserts. This controlled for transfection efficiency because each experiment was performed from a single transfection. Cells were subsequently treated with cytokines or inhibitors, as indicated. Luciferase expression in lysates was detected using luciferin as the substrate (Promega), measured with a Lumat LB 9507 luminometer (Berthold, Oak Ridge, TN), and normalized to total protein (BCA assay, Bio-Rad). Previous in vitro work has clearly established that IFN-γ8Bruewer M Luegering A Kucharzik T Parkos CA Madara JL Hopkins AM Nusrat A Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.J Immunol. 2003; 171: 6164-6172PubMed Google Scholar, 20Sugi K Musch MW Field M Chang EB Inhibition of Na+,K+-ATPase by interferon gamma down-regulates intestinal epithelial transport and barrier function.Gastroenterology. 2001; 120: 1393-1403Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (133) Google Scholar, 29Madara JL Stafford J Interferon-gamma directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.J Clin Invest. 1989; 83: 724-727Crossref PubMed Scopus (652) Google Scholar, 30Adams RB Planchon SM Roche JK IFN-gamma modulation of epithelial barrier function. Time course, reversibility, and site of cytokine binding.J Immunol. 1993; 150: 2356-2363PubMed Google Scholar and TNF-α7Ma TY Iwamoto GK Hoa NT Akotia V Pedram A Boivin MA Said HM TNF-alpha-induced increase in intestinal epithelial tight junction permeability requires NF-kappa B activation.Am J Physiol. 2004; 286: G367-G376Crossref Scopus (20) Google Scholar, 31Hiribarren A Heyman M L'Helgouac'h A Desjeux JF Effect of cytokines on the epithelial function of the human colon carcinoma cell line HT29 cl 19A.Gut. 1993; 34: 616-620Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar, 32Marano CW Laughlin KV Russo LM Soler A Peralta Mullin JM Long-term effects of tumor necrosis factor on LLC-PK1 transepithelial resistance.J Cell Physiol. 1993; 157: 519-527Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar, 33Yoo J Nichols A Song JC Mammen J Calvo I Worrell RT Cuppoletti J Matlin K Matthews JB Bryostatin-1 attenuates TNF-induced epithelial barrier dysfunction: role of novel PKC isozymes.Am J Physiol. 2003; 284: G703-G712Google Scholar, 34Mullin JM Laughlin KV Marano CW Russo LM Soler AP Modulation of tumor necrosis factor-induced increase in renal (LLC-PK1) transepithelial permeability.Am J Physiol. 1992; 263: F915-F924PubMed Google Scholar, 35Rodriguez P Heyman M Candalh C Blaton MA Bouchaud C Tumour necrosis factor-alpha induces morphological and functional alterations of intestinal HT29 cl. 19A cell monolayers.Cytokine. 1995; 7: 441-448Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 36Soler AP Marano CW Bryans M Miller RD Garulacan LA Mauldin SK Stamato TD Mullin JM Activation of NF-kappaB is necessary for the restoration of the barrier function of an epithelium undergoing TNF-alpha-induced apoptosis.Eur J Cell Biol. 1999; 78: 56-66Crossref PubMed Scopus (40) Google Scholar are capable of independently reducing barrier function in intestinal epithelial monolayers. However, it is also clear that these cytokines can synergize to induce barrier dysfunction.10Taylor CT Dzus AL Colgan SP Autocrine regulation of epithelial permeability by hypoxia: role for polarized release of tumor necrosis factor alpha.Gastroenterology. 1998; 114: 657-668Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar, 11Zolotarevsky Y Hecht G Koutsouris A Gonzalez DE Quan C Tom J Mrsny RJ Turner JR A membrane-permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease.Gastroenterology. 2002; 123: 163-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar Elevations of both cytokines are seen in intestinal disease in vivo.37Agnholt J Kaltoft K Infliximab downregulates interferon-gamma production in activated gut T-lymphocytes from patients with Crohn's disease.Cytokine. 2001; 15: 212-222Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar Thus, we developed an in vitro model similar to previous reports8Bruewer M Luegering A Kucharzik T Parkos CA Madara JL Hopkins AM Nusrat A Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.J Immunol. 2003; 171: 6164-6172PubMed Google Scholar, 9Schmitz H Fromm M Bentzel CJ Scholz P Detjen K Mankertz J Bode H Epple HJ Riecken EO Schulzke JD Tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) regulates the epithelial barrier in the human intestinal cell line HT-29/B6.J Cell Sci. 1999; 112: 137-146Crossref PubMed Google Scholar, 10Taylor CT Dzus AL Colgan SP Autocrine regulation of epithelial permeability by hypoxia: role for polarized release of tumor necrosis factor alpha.Gastroenterology. 1998; 114: 657-668Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (175) Google Scholar, 11Zolotarevsky Y Hecht G Koutsouris A Gonzalez DE Quan C Tom J Mrsny RJ Turner JR A membrane-permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease.Gastroenterology. 2002; 123: 163-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar in which low, physiologically relevant levels of IFN-γ and TNF-α are both required to decrease barrier function in cultured monolayers of intestinal epithelial Caco-2 cells. In this model TER, a sensitive measure of barrier function, was unaffected by 48 hours of culture with basolateral IFN-γ or TNF-α individually (Figure 1A). However, simultaneous application of both cytokines caused TER to fall, indicating reduced barrier function, within 30 hours (Figure 1A). To determine whether the synergy between IFN-γ and TNF-α required the two cytokines to be present simultaneously, we added one cytokine for 24 hours, washed monolayers free of that cytokine, and then added the second cytokine. Sequential treatment with IFN-γ followed by TNF-α caused TER decreases comparable to those induced by simultaneous treatment with IFN-γ and TNF-α (Figure 1A). In IFN-γ-primed monolayers TER began to decrease within 4 hours after TNF-α addition. In contrast, sequential treatment with TNF-α followed by IFN-γ did not affect TER (Figure 1A). Similarly, paracellular flux of 3-kD dextran was not significantly increased in monolayers treated with either IFN-γ or TNF-α alone, but was increased 21 ± 4-fold in monolayers treated sequentially with IFN-γ followed by TNF-α (Figure 1B). Thus, the synergy between these cytokines is because of the ability of IFN-γ treatment to prime monolayers to respond rapidly to physiologically relevant doses of TNF-α. Priming of Caco-2 monolayers with IFN-γ requires at least 18 hours of IFN-γ treatment (data not shown). Increasing IFN-γ treatment duration (up to 36 hours) or dose (up to 100 ng/ml) did not augment subsequent TNF-α-induced TER decreases (data not shown). In contrast, TER decreases induced by TNF-α addition to IFN-γ-primed monolayers were strongly correlated with TNF-α dose (r = 0.996, Figure 1C). Therefore, IFN-γ primes intestinal epithelial monolayers to respond to TNF-α in a dose-dependent manner. Some studies have suggested that TNF-α reduces epithelial barrier function by inducing apoptosis.38Abreu MT Palladino AA Arnold ET Kwon RS McRoberts JA Modulation of barrier function during Fas-mediated apoptosis in human intestinal epithelial cells.Gastroenterology. 2000; 119: 1524-1536Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (122) Google Scholar, 39Bojarski C Gitter AH Bendfeldt K Mankertz J Schmitz H Wagner S Fromm M Schulzke JD Permeability of human HT-29/B6 colonic epithelium as a function of apoptosis.J Physiol. 2001; 535: 541-552Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar However, others have shown barrier function to be maintained in the face of apoptosis,16Madara JL Maintenance of the macromolecular barrier at cell extrusion sites in intestinal epithelium: physiological rearrangement of tight junctions.J Membr Biol. 1990; 116: 177-184Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar, 17Rosenblatt J Raff MC Cramer LP An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.Curr Biol. 2001; 11: 1847-1857Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (416) Google Scholar and we11Zolotarevsky Y Hecht G Koutsouris A Gonzalez DE Quan C Tom J Mrsny RJ Turner JR A membrane-permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease.Gastroenterology. 2002; 123: 163-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (321) Google Scholar and others8Bruewer M Luegering A Kucharzik T Parkos CA Madara JL Hopkins AM Nusrat A Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.J Immunol. 2003; 171: 6164-6172PubMed Google Scholar have shown that this is not the mechanism by which IFN-γ and TNF-α induce barrier dysfunction. Consistent with this, caspase-3, caspase-8, and PARP cleavage were not increased by IFN-γ and TNF-α treatment of Caco-2 monolayers (Figure 2A). Thus, we considered the possibility that the barrier dysfunction observed represents disruption of the tight junction, the primary determinant of barrier function in intact monolayers. We first assessed the morphological distribution of tight junction proteins before and after cytokine treatment. In control monolayers the tight junction plaque protein ZO-1 was restricted to the tight junction, whereas the transmembrane proteins occludin and claudin-1 were detected at the tight junction, along lateral membranes, and within intracellular vesicular pools (Figure 2B). These distributions were not changed by incubation with IFN-γ (10 ng/ml) for 24 hours (data not shown). Treatment of IFN-γ-primed monolayers with TNF-α caused striking reorganization of ZO-1, occludin, and claudin-1 such that the en face xy profiles became irregular (Figure 2B). The intensity of staining for ZO-1 and occludin at the tight junction was also reduced, and expanded intracellular pools of occludin and claudin-1 were apparent after treatment of IFN-γ-primed monolayers with TNF-α (Figure 2B). This morphologically evident removal of occludin and claudin-1 from the tight junction was also associated with removal of occludin and claudin-1 from tight junction-enrich

Tight junctions serve as the rate-limiting barrier to passive movement of hydrophilic solutes across intestinal epithelia. After activation of Na+-glucose cotransport, the permeability of intestinal tight junctions is increased. Because previous analyses of this physiological tight junction regulation have been restricted to intact mucosae, dissection of the mechanisms underlying this process has been limited. To characterize this process, we have developed a reductionist model consisting of Caco-2 intestinal epithelial cells transfected with the intestinal Na+-glucose cotransporter, SGLT1. Monolayers of SGLT1 transfectants demonstrate physiological Na+-glucose cotransport. Activation of SGLT1 results in a 22 +/- 5% fall in transepithelial resistance (TER) (P < 0.001). Similarly, inactivation of SGLT1 by addition of phloridzin increases TER by 24 +/- 2% (P < 0.001). The increased tight junction permeability is size selective, with increased flux of small nutrient-sized molecules, e.g., mannitol, but not of larger molecules, e.g., inulin. SGLT1-dependent increases in tight junction permeability are inhibited by myosin light-chain kinase inhibitors (20 microM ML-7 or 40 microM ML-9), suggesting that myosin regulatory light-chain (MLC) phosphorylation is involved in tight junction regulation. Analysis of MLC phosphorylation showed a 2.08-fold increase after activation of SGLT1 (P < 0.01), which was inhibited by ML-9 (P < 0.01). Thus monolayers incubated with glucose and myosin light-chain kinase inhibitors are comparable to monolayers incubated with phloridzin. ML-9 also inhibits SGLT1-mediated tight junction regulation in small intestinal mucosa (P < 0.01). These data demonstrate that epithelial cells are the mediators of physiological tight junction regulation subsequent to SGLT1 activation. The intimate relationship between tight junction regulation and MLC phosphorylation suggests that a critical step in regulation of epithelial tight junction permeability may be myosin ATPase-mediated contraction of the perijunctional actomyosin ring and subsequent physical tension on the tight junction.

Epithelial tight junctions form a barrier against passive paracellular flux. This barrier is regulated by complex physiologic and pathophysiologic signals that acutely fine-tune tight junction permeability. Although actomyosin contraction and myosin light chain phosphorylation are clearly involved in some forms of tight junction regulation, the contributions of other signaling events and the role of myosin light chain phosphorylation in this response are poorly understood. Here we ask if activation of myosin light chain kinase alone is sufficient to induce downstream tight junction regulation. We use a confluent polarized intestinal epithelial cell model system in which constitutively active myosin light chain kinase, tMLCK, is expressed using an inducible promoter. tMLCK expression increases myosin light chain phosphorylation, reorganizes perijunctional F-actin, and increases tight junction permeability. TJ proteins ZO-1 and occludin are markedly redistributed, morphologically and biochemically, but effects on claudin-1 and claudin-2 are limited. tMLCK inhibition prevents changes in barrier function and tight junction organization induced by tMLCK expression, suggesting that these events both require myosin light chain phosphorylation. We conclude that myosin light chain phosphorylation alone is sufficient to induce tight junction regulation and provide new insights into the molecular mechanisms that mediate this regulation.

The rho family of GTP-binding proteins regulates actin filament organization. In unpolarized mammalian cells, rho proteins regulate the assembly of actin-containing stress fibers at the cell-matrix interface. Polarized epithelial cells, in contrast, are tall and cylindrical with well developed intercellular tight junctions that permit them to behave as biologic barriers. We report that rho regulates filamentous actin organization preferentially in the apical pole of polarized intestinal epithelial cells and, in so doing, influences the organization and permeability of the associated apical tight junctions. Thus, barrier function, which is an essential characteristic of columnar epithelia, is regulated by rho.

Mucosal organs such as the intestine are supported by a rich and complex underlying vasculature. For this reason, the intestine, and particularly barrier-protective epithelial cells, are susceptible to damage related to diminished blood flow and concomitant tissue hypoxia. We sought to identify compensatory mechanisms that protect epithelial barrier during episodes of intestinal hypoxia. Initial studies examining T84 colonic epithelial cells revealed that barrier function is uniquely resistant to changes elicited by hypoxia. A search for intestinal-specific, barrier-protective factors revealed that the human intestinal trefoil factor (ITF) gene promoter bears a previously unappreciated binding site for hypoxia-inducible factor (HIF)-1. Hypoxia resulted in parallel induction of ITF mRNA and protein. Electrophoretic mobility shift assay analysis using ITF-specific, HIF-1 consensus motifs resulted in a hypoxia-inducible DNA binding activity, and loading cells with antisense oligonucleotides directed against the α chain of HIF-1 resulted in a loss of ITF hypoxia inducibility. Moreover, addition of anti-ITF antibody resulted in a loss of barrier function in epithelial cells exposed to hypoxia, and the addition of recombinant human ITF to vascular endothelial cells partially protected endothelial cells from hypoxia-elicited barrier disruption. Extensions of these studies in vivo revealed prominent hypoxia-elicited increases in intestinal permeability in ITF null mice. HIF-1–dependent induction of ITF may provide an adaptive link for maintenance of barrier function during hypoxia.

Epithelial paracellular barrier function, determined primarily by tight junction permeability, is frequently disrupted in disease. In the intestine, barrier loss can be mediated by tumor necrosis factor (alpha) (TNF) signaling and epithelial myosin light chain kinase (MLCK) activation. However, TNF induces only limited alteration of tight junction morphology, and the events that couple structural reorganization to barrier regulation have not been defined. We have used in vivo imaging and transgenic mice expressing fluorescent-tagged occludin and ZO-1 fusion proteins to link occludin endocytosis to TNF-induced tight junction regulation. This endocytosis requires caveolin-1 and is essential for structural and functional tight junction regulation. These data demonstrate that MLCK activation triggers caveolin-1-dependent endocytosis of occludin to effect structural and functional tight junction regulation.

Background & AimsInflammatory bowel disease (IBD) is a multifactorial disease thought to be caused by alterations in epithelial function, innate and adaptive immunity, and luminal microbiota. The specific role of epithelial barrier function remains undefined, although increased activity of intestinal epithelial myosin light chain kinase (MLCK), which is the primary mechanism of tumor necrosis factor-induced barrier dysfunction, occurs in human IBD. Our aim was to determine whether, in an intact epithelium, primary dysregulation of the intestinal epithelial barrier by pathophysiologically relevant mechanisms can contribute to development of colitis.MethodsWe developed transgenic (Tg) mice that express constitutively active MLCK (CA-MLCK) specifically within intestinal epithelia. Their physiology, immune status, and susceptibility to disease were assessed and compared with non-Tg littermate controls.ResultsCA-MLCK Tg mice demonstrated significant barrier loss but grew and gained weight normally and did not develop spontaneous disease. CA-MLCK Tg mice did, however, develop mucosal immune activation demonstrated by increased numbers of lamina propria CD4+lymphocytes, redistribution of CD11c+cells, increased production of interferon-γ and tumor necrosis factor, as well as increased expression of epithelial major histocompatibility complex class I. When challenged with CD4+CD45+Rbhi lymphocytes, Tg mice developed an accelerated and more severe form of colitis and had shorter survival times than non-Tg littermates.ConclusionsPrimary pathophysiologically relevant intestinal epithelial barrier dysfunction is insufficient to cause experimental intestinal disease but can broadly activate mucosal immune responses and accelerate the onset and severity of immune-mediated colitis. Inflammatory bowel disease (IBD) is a multifactorial disease thought to be caused by alterations in epithelial function, innate and adaptive immunity, and luminal microbiota. The specific role of epithelial barrier function remains undefined, although increased activity of intestinal epithelial myosin light chain kinase (MLCK), which is the primary mechanism of tumor necrosis factor-induced barrier dysfunction, occurs in human IBD. Our aim was to determine whether, in an intact epithelium, primary dysregulation of the intestinal epithelial barrier by pathophysiologically relevant mechanisms can contribute to development of colitis. We developed transgenic (Tg) mice that express constitutively active MLCK (CA-MLCK) specifically within intestinal epithelia. Their physiology, immune status, and susceptibility to disease were assessed and compared with non-Tg littermate controls. CA-MLCK Tg mice demonstrated significant barrier loss but grew and gained weight normally and did not develop spontaneous disease. CA-MLCK Tg mice did, however, develop mucosal immune activation demonstrated by increased numbers of lamina propria CD4+lymphocytes, redistribution of CD11c+cells, increased production of interferon-γ and tumor necrosis factor, as well as increased expression of epithelial major histocompatibility complex class I. When challenged with CD4+CD45+Rbhi lymphocytes, Tg mice developed an accelerated and more severe form of colitis and had shorter survival times than non-Tg littermates. Primary pathophysiologically relevant intestinal epithelial barrier dysfunction is insufficient to cause experimental intestinal disease but can broadly activate mucosal immune responses and accelerate the onset and severity of immune-mediated colitis.

Based on preliminary evidence indicating that a cell-associated protein of U937 (a human monocyte-like cell line) possessed cofactor activity and was not the C3b/C4b receptor, we sought to further characterize this protein. A sequential four-column purification procedure was devised that includes C3(H2O) affinity chromatography to isolate in reasonable yields and purity a cell-associated protein of U937 and several other human cell lines. Based on its pattern and Mr on SDS-PAGE, acidic pI, and ligand specificity, it is identical to a recently described C3(H2O) or C3b-binding membrane glycoprotein of human PBL and cell lines; having no presently identified function, it was termed gp45-70. After purifying this protein, we determined its functional capabilities and compared them to those of the other complement proteins with regulatory activity directed at components comprising the C3 convertases. This protein was the most efficient (50 times that of H) yet-described cofactor for the I-mediated first cleavage of C3b. It also was a cofactor for the first cleavage of C4b, but was not as efficient as C4bp. The second cleavage of C3b and C4b was not efficiently mediated. It had no ability to accelerate decay in the classical or alternative pathway C3 convertases. Based on this unique activity profile and ability to be surface labeled, we have renamed this molecule membrane cofactor protein (MCP). We suggest that this protein plays a major role in preventing autologous complement activation.

CD95, known also as Fas and APO-1, is a classical death receptor that regulates tissue homeostasis through apoptosis. Here it is shown that cancer cells, regardless of their sensitivity to CD95-induced apoptosis, depend for optimal growth on CD95. Without CD95 the incidence of ovarian cancer and liver cancer in mice models is reduced, as is their tumour size. CD95 therefore appears to be a double-edged sword: in order to kill tumour cells it may be necessary to reduce, rather than enhance, CD95 activity. CD95 is a classical death receptor protein that regulates tissue homeostasis by inducing cell death. Here it is shown, however, that cancer cells depend on CD95 for optimal growth. Without CD95, the incidence of ovarian cancer and liver cancer in mice is reduced, as is the size of any tumours. So CD95 is a double-edged sword, and it may be necessary to reduce, rather than enhance, its activity in order to kill tumour cells. CD95 (also called Fas and APO-1) is a prototypical death receptor that regulates tissue homeostasis mainly in the immune system through the induction of apoptosis1,2,3. During cancer progression CD95 is frequently downregulated or cells are rendered apoptosis resistant4,5, raising the possibility that loss of CD95 is part of a mechanism for tumour evasion. However, complete loss of CD95 is rarely seen in human cancers4 and many cancer cells express large quantities of CD95 and are highly sensitive to CD95-mediated apoptosis in vitro. Furthermore, cancer patients frequently have elevated levels of the physiological ligand for CD95, CD95L6. These data raise the possibility that CD95 could actually promote the growth of tumours through its non-apoptotic activities7. Here we show that cancer cells in general, regardless of their CD95 apoptosis sensitivity, depend on constitutive activity of CD95, stimulated by cancer-produced CD95L, for optimal growth. Consistently, loss of CD95 in mouse models of ovarian cancer and liver cancer reduces cancer incidence as well as the size of the tumours. The tumorigenic activity of CD95 is mediated by a pathway involving JNK and Jun. These results demonstrate that CD95 has a growth-promoting role during tumorigenesis and indicate that efforts to inhibit its activity rather than to enhance it should be considered during cancer therapy.

ABSTRACT A tight junction (TJ) protein, claudin-1 (CLDN1), was identified recently as a key factor for hepatitis C virus (HCV) entry. Here, we show that another TJ protein, occludin, is also required for HCV entry. Mutational study of CLDN1 revealed that its tight junctional distribution plays an important role in mediating viral entry. Together, these data support the model in which HCV enters liver cells from the TJ. Interestingly, HCV infection of Huh-7 hepatoma cells downregulated the expression of CLDN1 and occludin, preventing superinfection. The altered TJ protein expression may contribute to the morphological and functional changes observed in HCV-infected hepatocytes.