SUMMARY Little is known about the decisions behind transcription elongation versus termination in the human pathogen Mycobacterium tuberculosis . By applying Term-seq to M. tuberculosis we found that the majority of transcription termination is premature and associated with translated regions, i.e. within previously annotated or newly identified open reading frames. Computational predictions and Term-seq analysis upon depletion of termination factor Rho suggests that Rho-dependent transcription termination dominates all TTS including those associated with regulatory 5’ leaders. Moreover, our results suggest that tightly coupled translation, in the form of overlapping stop and start codons, may suppress Rho-dependent termination. This study provides detailed insights into novel M. tuberculosis cis -regulatory elements, where Rho-dependent, conditional termination of transcription and translational coupling together play major roles in gene expression control. Our findings contribute to a deeper understanding of the fundamental regulatory mechanisms that enable M. tuberculosis adaptation to the host environment offering novel potential points of intervention.

ABSTRACT Almost 140 years after the identification of Mycobacterium tuberculosis as the etiological agent of tuberculosis, important aspects of its biology remain poorly described. Little is known about the role of post-transcriptional control of gene expression and RNA biology, including the role of most of the small RNAs (sRNAs) identified to date. We have carried out a detailed investigation of the M. tuberculosis sRNA, F6, and shown it to be dependent on SigF for expression, and significantly induced in starvation conditions in vitro and in a mouse model of infection. Further exploration of F6 using an in vitro starvation model of infection indicates that F6 affects the expression of the essential chaperonins, GroEL2 and GroES. Our results point towards a role for F6 during periods of low metabolic activity typically associated with long-term survival of M. tuberculosis in human granulomas.

ABSTRACT Cobalamin is an essential co-factor in all domains of life, yet its biosynthesis is restricted to some bacteria and archaea. Mycobacterium smegmatis , an environmental saprophyte frequently used as surrogate for the obligate human pathogen, M. tuberculosis , carries approximately 30 genes predicted to be involved in de novo cobalamin biosynthesis. M. smegmatis also encodes multiple cobalamin-dependent enzymes, including MetH, a methionine synthase which catalyses the final reaction in methionine biosynthesis. In addition to metH , M. smegmatis possesses a cobalamin-independent methionine synthase, metE , suggesting that enzyme selection – MetH or MetE – is regulated by cobalamin availability. Consistent with this notion, we previously described a cobalamin-sensing riboswitch controlling metE expression in M. tuberculosis . Here, we apply a targeted mass spectrometry-based approach to confirm de novo cobalamin biosynthesis in M. smegmatis during aerobic growth in vitro . We also demonstrate that M. smegmatis transports and assimilates exogenous cyanocobalamin (CNCbl; a.k.a. vitamin B 12 ) and its precursor, dicyanocobinamide ((CN) 2 Cbi). Interestingly, the uptake of CNCbl and (CN) 2 Cbi appears restricted in M. smegmatis and dependent on the conditional essentiality of the cobalamin-dependent methionine synthase. Using gene and protein expression analyses combined with single-cell growth kinetics and live-cell time-lapse microscopy, we show that transcription and translation of metE are strongly attenuated by endogenous cobalamin. These results support the inference that metH essentiality in M. smegmatis results from riboswitch-mediated repression of MetE expression. Moreover, differences observed in cobalamin-dependent metabolism between M. smegmatis and M. tuberculosis provide some insight into the selective pressures which might have shaped mycobacterial metabolism for pathogenicity. IMPORTANCE Accumulating evidence suggests that alterations in cobalamin-dependent metabolism marked the evolution of Mycobacterium tuberculosis from an environmental ancestor to an obligate human pathogen. However, the roles of cobalamin in mycobacterial physiology and pathogenicity remain poorly understood. We used the non-pathogenic saprophyte, M. smegmatis , to investigate the production of cobalamin, transport and assimilation of cobalamin precursors, and the potential role of cobalamin in regulating methionine biosynthesis. We provide biochemical and genetic evidence confirming constitutive de novo cobalamin biosynthesis in M. smegmatis under standard laboratory conditions, in contrast with M. tuberculosis , which appears to lack de novo cobalamin biosynthetic capacity. We also demonstrate that the uptake of cyanocobalamin (vitamin B 12 ) and its precursors is restricted in M. smegmatis , apparently depending on the need to service the co-factor requirements of the cobalamin-dependent methionine synthase. These observations support the utility of M. smegmatis as a model to elucidate key metabolic adaptations enabling mycobacterial pathogenicity.

Abstract Vitamin B 12 (B 12 ), an essential cofactor in all domains of life, is produced de novo by only a small subset of prokaryotes, but B 12 -sensing riboswitches are some of the most widely distributed riboswitches in bacteria. Mycobacterium tuberculosis , the causative agent of the ongoing tuberculosis pandemic, encodes two distinct vitamin B 12 riboswitches. One controls the expression of metE , encoding a B 12 -independent methionine synthase, while the other is located upstream of ppe2, a PE/PPE family gene whose function is still unresolved. Here, we analyse ligand sensing, secondary structure architecture, and gene expression control mechanisms of these two riboswitches. Our results provide the first evidence of direct ligand binding by metE and ppe2 riboswitches and show that the two switches exhibit different preferences for natural isoforms of B 12 , use distinct regulatory and structural elements, and act as translational OFF switches. Based on our results, we propose that the ppe2 switch represents a new Class IIc of B 12 -sensing riboswitches. Moreover, we have identified small translated open reading frames (uORFs) upstream of both metE and ppe2 , which modulate the expression of the respective downstream genes in opposite directions. Translation of the metE riboswitch uORF suppresses MetE expression, while translation of the uORF in the ppe2 switch is essential for PPE2 expression via the synthesis of a uORF-PPE2 fusion protein. In summary, our findings reveal an unexpected diversity and complexity of B 12 -dependent cis -regulation in M. tuberculosis , with potential implications for host-pathogen interactions.